Læknablaðið : fylgirit - 01.09.1993, Blaðsíða 24

22
LÆKNABLAÐIÐ/FYLGIRIT 24
E 10
SAMEINDAERFÐAFRÆÐI HEILKENNIS
HUNTERS: ÁKVÖRÐUN STÖKK-
BREYTINGA MED SJÁLFVIRKRI
RAÐGREININGU OG TÖLVUTÚLKUN.
Jón Jóhannes Jónsson, Elena L. Aronovich,
Stephen E. Braun, Chester B. Whitley.
Mannerfðafræðistofnun Minnesotaháskóla,
Minneapolis, Bandaríkjunum.
Heilkenni Hunters er kynbundinn erfðasjúkdómur sem
stafar af skorti á ídúrónat-2-súlfatasa (IDS).
Sjúkdómsgangur er mjög mismunandi allt frá dauða á
unga aldri vegna uppitleðslu glýkósamínóglýkana til
vægra einkenna á fullorðinsárum. Talið er að
sjúldingar með vægan sjúkdóm hafi skert IDS ensím
með sneftlvirkni sem er ekki mælanleg með núverandi
aðferðum. Akvörðun á stökkbreytingum í IDS geninu
gæti því sagt fyrir um sjúkdómshorfur hjá einstökum
sjúklingum og jafnframt auðveldað greiningu á
arfberum í fjölskyidum sjúklinga. Við þróuðum
áreiðanlega og fljótvirka aðferð til að finna hinar ýmsu
stökkbreytingar í IDS geninu. DNA var einangrað úr
blóðfrumum og skimað var fyrir brottföllum á IDS
geninu með því að keðjufjölfalda (PCR) búta sem
samsvara endum gensins. RNA var einnig einangrað,
IDS mRNA var víxlritað í cDNA og það síðan
keðjufjölfaldað í tveimur skrefum. Tíu vísar
(“primers”) voru notaðir til að raðgreinda PCR
margfeldin með sjálfvirku tæki ("Applied Biosystems
Automated DNA Sequencer 373A"). Bæði basaröðin
og -línuritin frá raðgreininum voru borin saman við
niðurstöður frá eðlilegum IDS genum í Sun tölvu með
hjálp Staden raðgreiningarforrita. Með þessari aðferð
höfum við fundið nýjar stökkbreytingar í 8
sjúklingum. Fimm sjúklingar með slæman sjúkdóm
voru rannsakaðir. Tveir höfðu markleysubreytingar þ.
e. C514-»T, Argl72X og C1165-»T, Gln389X. Tveir
sjúklinganna höfðu mislestursbreytingar C685-»T,
His229Tyr og C1073-»G, Pro358Arg. Einn
sjúklingur með slæman sjúkdóm var með brottfall á
þriðju útröðinni. Þetta leiddi til fasaskiptis í táknröð
eftir 80 amínósýrur og stöðvun á þýðingu eftir 152
amínósýrur. Báðir sjúklingamir með vægan sjúkdóm,
sem við höfum athugað, voru með
mislestursbreytingar þ. e. C1406-»A, Pro469His og
A1568-»G Tyr523Cys. Einn sjúklingur var með
stökkbreytinguna G1403-»A, Arg468Gln. Hann hafði
jafnframt litningatilfærslu svo mat á sjúkdómsástandi
var erfitt. Rannsóknir okkar og annarra sýna að
sjúklingar með heilkenni Hunters hafa oftast
mismunandi stökkbreytingar í IDS táknröðinni og að
líklega sé fylgni á milli afleiðingar stökkbreytinganna
fyrir próteinið og sjúkdómsgangs.
E 11
VÍXLVEIRUFERJUR SEM INNIHALDA
TÁKNRÖÐINA FYRIR ÍDÚRÓNAT-2-
SÚLFATASA LAGFÆRA EFNASKIPTA-
GALLANN í EITILFRUMUM ÚR
SJÚKLINGUM MEÐ HEILKENNI
HUNTERS.
Jón Jóhannes Jónsson, Stephen E. Braun, Elena
L. Aronovich, Dao Pan, R. Scott Mclvor, Chester B.
Whitley. Mannerfðafræðistofnun Minnesotaháskóla.
Heilkenni Hunters er kynbundinn erfðasjúkdómur sem
stafar af skorti á ídúrónat-2-súlfatasa (IDS).
Hugsanlega er hægt að meðhöndla sjúkdóminn með
því að flytja IDS gen inn í blóðfrumur þar eð IDS
ensímið getur eins og sum önnur lýsósómal ensím
flutst milli frumna. Við bjuggum til fjórar
víxlveiruferjur (retróveiruferjur) sem innihéldu IDS
táknröðina undir stjóm mismundi stýriraða. PA317
pökkunarfrumur, sem framleiddu viðkomandi
víxlveiruferjur í miklu magni, voru einræktaðar.
Eitilfrumur úr Hunter sjúklingum (umbreyttar með
Epstein-Barr veiru þ. e. LCLh frumur) vom sýktar
með frumuræktunarvökva frá PA317 frumum og
athugaðar þrem dögum seinna. Allar LCLh fmmur
sýktar með einni af fjórum mismunandi ferjum
innihéldu svipaða IDS virkni og LCL frumur frá
heilbrigðum einstaklingum þrátt fyrir að einungis 0,5
til 3% frumnanna væri sýkt:
PA317 Títer IDS virkni Tíðni IDS virkni
klón cfu/mla í PA317 klónum* Sýkingar^ ILCLHd
PA-L2SN 3 x 106 100.000 2-3% 1400
PA-LNC2 1 x 106 120.000 1-2% 1200
PA-pL2 5x 105 250.000 1% 1300
PA-pLB2 5 x 105 520.000 0,5-1% 500
°LB2 and L2 mælt með Southemblettun á DNA úr sýktum NIH
3T3 frumum. *IDS virkni f ósýklum PA137 frumum 1800
U/mg/klst. cMæld með keðjufjölföldun (PCR). <fIDS virkni í
LCL frumum frá heilbrigðum einstaklingum 700 U/mg/klst.
Svipaðar niðurstöður fengust þegar nýeinangraðar
eitilfrumur frá Hunter sjúklingum voru notaðar sem
markfrumur. Sýktar LCLh frumur voru valdar úr
útsettum frumum með G418 lyfjagjöf í frumuræktanir í
1 mánuð. IDS virkni jókst við það 13 falt í 18.600
U/mg/klst. í frumum sýktum með L2SN veirunni og
22 falt í 25.800 U/mg/klst. í frumum sýktum með
LNC2 veirunni. LCLh frumur sýktar með L2SN
veirunni brutu niður glýkósamt'nóglýkön á eðlilegan
hátt (þ. e. upphleðsla geislamerkts SO4 átti sér ekki
stað). IDS ensím framleitt af L2SN veirufeiju í LCLh
frumum gat einnig flutst yftr í Hunter bandvefsfrumur
og brotið þar niður áður uppsöfnuð
glýkósamínóglýkön.
Þessar niðurstöður benda til að hægt sé að meðhöndla
Hunter sjúklinga með genalækningum þrátt fyrir
núverandi takmarkanir á skilvirkni genafluminga inn í
blóðfrumur.