Læknablaðið : fylgirit - 01.09.1993, Blaðsíða 23
LÆKNABLAÐIÐ/FYLGIRIT 24
21
E 8
ÞRÓUN VÍXLVEIRUFERJA SEM FLYTJA
PÚRÍN NÚKLEÓSÍÐ FOSFORÝLASA GEN
MED INNRÖÐUM OG NÁTTÚRULEGUM
STÝRIRÖÐUM.
Jón Jóhanncs Jónsson, Don Habel, Andrea
Converse, R. Scott Mclvor. Mannerfðafræðistofnun
Minnesotaháskóla, Minneapolis, Bandaríkjunum.
T-frumu ónæmisbilun af völdum púrín núkleósíð
fosforýlasa (PNP) skorts er talin kjörsjúkdómur til
erfðaefnislækninga. Við höfum áður sýnt fram á að
fyrsta innröð PNP gensins verður að vera til staðar svo
að tjáning sé skilvirk (Nucleic Acids Research 1992;
20:3191-8). Víxlveirufetjur ("retroviral vectors") eru
besta aðferðin tíl að flytja gen inn blóðfrumur. Við
bjuggum því tíl víxlveirufetjur sem innhéldu PNP gen í
öfugri röð miðað við stefnu veirunnar. Með þessu
fyrirkomulagi varð mótsvarandi strengur PNP gensins
hluri af RNA mólikúli víxlveirunnar sem flutist milli
fhimnanna. Þetta er eina leiðin tíl að flytja gen með
innröðum í víxlveirufeijum.
Tíð brottföll í PNP geninu áttu sér stað við flutninga
með þessum PNP-veiruferjum. Sum brottföllin virtust
stafa af framnina víxlrita ("reverse transcriptase
slippage"). Önnur brottföll stöfuðu af tveim 5'
splæsstöðum (“splice sites”) og þrem 3' splæsstöðum
sem fyrir tilviljun voru til staðar á 3,0 kb löngum
PREIMPLANTATION PREVENTION OF
DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY BY
ANALYSES OF PREAMPLIFIED SINGLE
CELL GENOME
mótsvarandi streng PNP gensins. Með því að leita í
basaröð mótsvarandi strengsins af basaröðum sem
líktust splæsstöðum var hægt að spá fyrir um 5'
splæsstaðina en ekki 3' splæsstaðina.
Marvíslegar breytingar voru gerðar á PNP geninu með
erfðatæknilegum aðferðum til að hindra brottföll við
víxlveiruflutninga. 5' splæsstaðimir tveir voru gerðir
óvirkir með markvissum stökkbreytingum á völdum
bösum. Einnig var 3’ síða PNP gens í víxlveiru, sem
innhélt stórt brottfall, einræktuð með keðjufjölföldun
(PCR) og notuð í staðinn fyrir langa náttúrlega 3' síðu.
5' óþýdda röð PNP gensins (þ. e. sá hluti gensins sem
er umritaður en ekki þýddur) var breytt og stytt ril að
fjarlægja svæði sem talið var stuðla að framruna
víxlrita við tímgun víxlveirunnar. Engin breytínganna
hafði marktæk áhrif á tjáningu PNP gensins. PNP gen
með allar þessar breyringar var 2,9 kb langt og innhélt
auk táknraðarinnar 547 bp 5' síðu, 855 bp fyrstu
innröð og 0.1 kb 3', síðu. Þetta gen var flutt í öfugri
röð í víxlveiruferjum án brottfalla í 23% (5/22) tílvika í
fyrsta tímgunarhring og í 87% (20/23%) tilvika í
öðrum tímgunarhring veirufeijunnar.
Okkur tókst því að búa til mjög virkt PNP gen sem
innihélt fyrstu innröð og náttúrulegar stýriraðir. Þetta
gen var hægt að flytja í öfugri röð með
víxlveirufetjum.
Kristleifur Kristjánsson, Samuel S. Chong, Igna Van
den Veyver, Michael C. Snabes and Mark R. Hughes.
Instimte for Molecular Genetícs, Baylor College of
Medicine, Houston , Texas.
Preimplantation diagnosis of inherited diseases has
become a reality with the techniques of in vitro
fertilizatíon, blastomere biopsy of the 6-8 cell embryo and
single cell DNA analyses. These methods allow selectíve
uterine transfer of unaffected embryos from at risk couples
and frees then ffom decisions about avoiding or
terminating pregnancies, only to be faced with the same
recurrence risk in future attempts.
Duchenne or Becker Muscular Dystrophy
(DMD/BMD) affects approximately one in 3500 newbom
males and one third of all cases arise from a new mutation
or represent gonadal mosaicism. 55-65 % of all cases of
DMD/BMD result from partial deletíons in the dystrophin
gene on chromosome Xp21. Multiplex PCR conditions
that detect 98 % of all those deletions detectable by
Southem analyses (46 % of all cases) have now been
established.
Presently, the only preimplantatíon option for at
risk couples of X-linked disease like DMD is female sex
selectíon. PCR analyses of sex chromosome specific
sequences or fluorescent in situ hybridizatíon (FISH) with
sex chromosome-specific probes allows selectíve
intrauterine transfer of female embryos of mcthers who are
carriers of X-linked diseases.
Primer extension preamplificatíon (PEP) increases
the scope and capacity of single cell DNA diagnosis by
generating sufficient template to perform multíple
subsequent analyses by the polymerase chain reactíon
(PCR). We analyzed single cells at the dystrophin exons
4, 8, 12, 45 and 48, and at the ZFX/ZFY loci. 96 %
(43/45) of the PEP reactions were successful, fforn which
98 % (190/194) of aliquots amplified successfully after
nested or heminested PCR. A blinded analyses of single
lymphoblasts from several male patient cell lines with
known exon deletions produced a 93 % (13/14) diagnostic
accuracy. With PEP, it is now possible to perform
compUmentary dystrophin exon analyscs and sex
identification on an isolated human blastomere for
preimplantation prevenrion of DMD. Transfer of
unaffected male embryos, impossible with sexing alone,
and improved diagnostic reliabihty, are achieved with the
abUity to perform repUcate multí-locus analyses ffom the
same blastomere.