Læknaneminn - 01.04.2010, Qupperneq 95

dvfnun var þó ekki tölfræðilega marktæk og
ekki eins afgerandi hér og áður hefur sést.
Ekki sást afgerandi samband milli C4B*Q0 og
LLT (GOLD-I) en dvínun C4B*Q0 með aldri
sást einnig þar.
Umræður
Þessar niðurstöður sýna að C4B*Q0 er
áhættuþáttur fyrir LLT (GOLD-II), líkt og fyrir
kransæðasjúkdóm, og í báðum tilvikum virðist
um að ræða samverkan C4B*Q0 og reykinga.
C4B*Q0-arfberar virðast svo á einhvern hátt
vera mun næmari fyrir skaðlegum áhrifum
reykinga en þeir sem ekki bera arfgerðina.
Þessi næmni endurspeglast í dvínandi
tíðni C4B*Q0 með aldri hjá heilbrigðum
reykingamönnum. Þessi dvínun varð minni
í núverandi rannsókn en búist var við, en
benda má á, að fjöldi kransæðasjúklinga er
hugsanlega vanmetinn í BOLD-rannsókninni
þar sem hann byggir einungís á svari við
spurningu um hvort sjúklingur hafi verið
greindur með kransæðasjúkdóm, en ekki á
skoðun. Þessi hópur verður skoðaður aftur
að tveimur árum liðnum og fæst þá úr þessu
greint.
Ályktun
Arfberar með C4B*Q0 eru sérstaklega næmir
fyrir skaðlegum áhrifum reykinga, og ef þeir
reykja þá eru þeir í verulegri hættu á að fá
kransæðasjúkdóm eða LLT (GOLD-II) um
miðjan aldur.
Breytileiki í genatjáningu L68Q cystatin C
arfbera
Inngangur
Arfgeng heilablæðing er erfðasjúkdómur sem
finnst eingöngu á íslandi. Hann erfist rikjandi
og ókynbundið. Sjúkdómurinn orsakast af
mislestursstökkbreytingu í cystatin C sem
leiðir til þess að prótíníð verður óstöðugt, er
brotið niður og myndar útfellingar í slagæðum
heilans. Útfellingarnar valda þykknun á
æðaveggjum, að lokum rofna æðarnar og
það blæðir inn á heilann. Blæðingarnar geta
valdið skyndilegum dauða eða valdið ýmsum
einkennum eins og heilabilun. Meðalllftimi
kvenna er 30,2 ár en 32 ár fyrir karlmenn.
Skoðuð voru fjögur gen sem voru misjafnlega
tjáð milli arfbera og viðmiðunarsjúklinga,
L-PGDS, SFRP2, COLIVAl og CTGF. Tvö af
þeim, L-PGDS og SFRP2 voru misjafnlega
tjáð milli langlífra og ungra arfbera. COLIVAl
og CTGF voru skoðuð vegna fyrri athugana
þar sem hefur sést að kollagen magn eykst
í æðaveggjunum og CTGF getur örvað
myndun þess.
Efniviður og aðferðir
Notaðar voru þrjár aðferðir til þess að
staðfesta greininguna é genatjáningu
með DNA örflögutækninni. Raun tíma
kjarnsýrumögnun var notuð til þess að
staðfesta greininguna á genatjáningunni.
Ónæmisblettun var notuð til þess að
staðfesta að mismunurinn kæmi fram í prótín
framleiðslunni. Ónæmislitanir voru til þess
að staðfesta prótín framleiðsluna og til að
staðsetja prótínið. Aðeins L-PGDS var skoðað
með öllum þessum aðferðum.
Niðurstöður
Raun tíma kjarnsýrumögnunin fyrir L-PGDS,
SFRP2, COLIVAl og CTGF samræmdist
greininingu DNA örflögutækninnar að nokkru
leiti. Aukin tjáning var á L-PGDS hjá langlífum
arfberum en sFRP2 var aðeins aukið hjá einum
þeirra. Hægt var að sjá smá tilhneigingu til
aukinnar tjáningar á COLIVA1 hjá arfberum en
engin hækkun var að sjá á CTGF. Niðurstöður
úr Western blot fyrir L-PGDS voru ómarktækar
þar sem mótefnið sem var notað virkaði
ekkiþar sem ósértæk litun kom fram.
Ónæmislitanir sýndu að L-PGDS er staðsett í
æðaveggjunum í heilasneiður frá arfberum.
Með flúrljómun mótefnalitun var hægt að
sjá samleitni milli cystatin C og L-PGDS. Þó
var einnig litun fyrir L-PGDS í æðaveggjum
viðmiðunar-einstaklinga. L-PGDS var einnig
staðsett í amy- loid p (A|3) skellum hjá
Alzheimers sjúklingi.
Umræður
Kanekiyo og félagar höfðu áður sýnt fram á
að L-PGDS er Af5 bindiprótín og því vaknaði
upp sú spurning hvort L-PGDS gæti haft sama
hlutverk í arfgengri heilablæðingu. Það gæti
þá verið hluti af útskýringunni af hverju sumir
arfberar lifa eðlilegu lífi meðan aðrir látast
langtfyriraldurfram.
Tjáning SFRP2 var aukin í einum langlífum
arfbera en greining á tjáningu með DNA
örflögutækni sýndi að CC8 hefði líka aukna
tjáningu. Óljóst er hvernig á því stendur að
CC2 er eini með aukna tjáningu en óvíst er
hvort það spili inn í að hann er eini arfberinn
sem erfir stökkbreytinguna frá föður.
Fyrri rannsóknir hafa sýnt að kollagen finnst í
auknu magni í æðaveggjum arfbera. Þar sem
CTGF örvar myndun kollagens og er hluti
af TGF-p boðleiðinni er talið hugsanlegt að
TGF-(3 hafi hlutverk í meinmynd arfgengar
heilablæðingar. Vitað er að cystatin C getur
hamlað bindingu TGF-p við viðtaka sinn en
ekki er víst að hvort að stökkbreytt cystatin
C geti bundist við viðtakann og er magn þess
líka bara um þriðjungur þess sem finnst í
heilbrigðum einstaklingum.
Designing and cloning of short hairpin
RNAs into a retroviral vector
Guðrún Arna Jóhannsdóttir, Pekka Jaako
and Stefán Karlsson
Department of Molecular Medicine and Gene
Therapy, Lund University hospital, Lund, Sweden
Objective
RNA interference (RNAi) is a cellular process
where double-stranded RNA (dsRNA) intro-
duced into cells knocks down expression of
a homologous gene with fully or partially
complementary sequences. The dsRNA can be
either endogenous or exogenous. The main
naturally occurring small RNAs are short inter-
fering RNAs (siRNAs) and micro RNAs (miRNAs).
Over the last three decades RNAi has been
a popular research object and it has been
increasingly applied as a tool in molecular
biology and therapeutics. The aim of the
current project was to design miRNA-styled
shRNAs against three selected candidate
genes that might have an interesting
mechanistic role in Diamond-Blackfan
anemia, and clone them into a retroviral
expression vector.
Materials and Methods
Six hairpin primers were designed targeting
mouse p21, RBl and ALAS2, two hairpin
primers targeting each gene. To complete
the production of the shRNA oligonucleotide
a loop and immediate flanking sequences of
miR-30 miRNA were incorporated into the
hairpin primers. Polymerase chain reaction
(PCR) was used for amplification of the shRNA
oligonucleotide. PCR products were digested
with Xhol and EcoRI restriction enzymes
and ligated into pMSCV-miR30 retroviral
expression vectors. After transformation,
antibiotic selection was aþþlied to screen
insert-positive colonies, which were eventually
confirmed by sequencing.
Results
DNA sequencing of the shRNA-inserts
confirmed that the cloning was done
successfully with three hairpin primers out
of six.
Conclusion
After a successful cloning, shRNA-carrying
retroviruses are going to be produced by
transfecting a virus-producing cell line with
the created retroviral expression vector.
These viruses are then used for transducing
bone-marrow cells from a Diamond-Blackfan
anemia mouse model in order to study if
silencing of these genes can reverse the
disease phenotype both in vitro and in vivo.