Læknaneminn - 01.04.2007, Qupperneq 118

Rannsóknarqrein
(fengnar frá Dr. Christine Mummery). Frumurnar eru
venjulega geymdar við -180°C í fljótandi nituroxíði.
Frumurnar voru afþýddar og var notast við gelatínhúðaða
frumubakka (NUNC) við ræktun þeirra í hitaskáp við 37°C.
Frumum var umsáð annan hvern dag og notast var við
skilyrt æti (BRL conditioned medium) sem innihélt LIF
vaxtarþáttinn til að halda frumum ósérhæfðum. Nákvæmt
innihald ætisins var DMEM lausn, 15% FCS (fetal calf
serum), 50 U/ml Penicillin, 50 mg/ml Streptomycin, 2 mM
Glútamín, beta-Mercaptoethanol og LIF vaxtarþátturinn.
Sérhæfingarferlið
Til að fá mES frumurnar til að sérhæfast voru útbúnar
svonefndar frumuþyrpingar (aggregates) í ofangreindu æti
án LIF. Ferlið er þannig að frumurækt er leyst upp og
frumutalning framkvæmd með Ijóssmásjá (Leitz-Labovert
FS). Með útreiknuðum þynningum var útbúin frumulausn
þar sem hver 20 pl dropi innihélt um 800 frumur. Dropum
var komið fyrir í hangandi stöðu á frumuræktunarloki og
látnir mynda frumuflóka (embryoid bodies = EB) á 5
dögum.
Eftir það voru EB fjarlægðar úr dropunum með 200 pl
pípettu og komið fyrir í gelatínhúðuðum brunnum þar sem
frumuþyrpingar mynduðust. Þyrpingar voru látnar vaxa í
þrunnum í 7-8 daga og innihéldu þær sama æti án LIF að
viðbættum mismunandi vaxtarþáttum (tafla 1).
Vaxtarþættir notaðir í rækt frumuþyrpinga
1. TGF-beta (1 ng/ml)
2. Activin A 10 ng/ml)__________________
3. BMP4 (10,25,50 ng/ml)
4. Enginn vaxtarþáttur í æti (control)
Örvun með vaxtarþáttum
Áður en þyrpingar voru litaðar með mótefnum voru þær
sveltar og örvaðar með viðeigandi vaxtarþáttum á ný til að
eiga möguleika á sterkari virkni innanfrumuboðleiða.
Frumur voru sveltar í æti án sermis í 4 klst og örvaðar í æti
með vaxtarþáttum í 1 klst. Að því loknu voru frumur
fixeraðar í 2% parraffin lausn og smásjárgler útbúin.
Mótefnalitanir
Frumur voru litaðar með prímer og sekúnder mótefnum
auk þess sem notast var við Topro lit til að greina kjarna
(tafla 2 og 3 ). Til að útiloka falskar litanir voru lituð
viðmiðunarsýni.
Prímer mótefni gegn próteinum úrTGF-beta boðleiðinni,
Smadl (Idl) og Smad2, voru merkt með grænu flúrljómandi
mótefni. Prímer mótefni gegn ósérhæfða stofnfrumu-
markernum Oct4 og sérhæfði hjartavöðvafrumumarkerinn
a-actinin merktur með rauðu mótefni.
Notast var við a-actinin en sannað þykir að þar er góður
vöðvafrumumarker á ferðinni (28). Til að greina
frumukjarna var notast við Topro lit. Mótefnalitanir voru
greindar með svokallaðri Confocal leysismásjá sem tilheyrir
Læknadeild HÍ. Staðsetning þessara markera átti gefa til
kynna hvort/hvaða boðleið TGF-beta stórfjölskyldunnar er
virkjuðívefjasérækumafurðum mESfrumna. Ef staðsetning
Idl eða fosfærðra Smads skarast við a-actinin gefur hún til
kynna að TGF-beta/Activin- eða BMP boðleiðin sé virkjuð
við myndun hjartavöðvafruma.
Sekúnder mótefni Þynning Eiginleikar
Goat-Anti-Rabbit (IgG2-FITC) 1:200 Binst sértækt við prímer mótefnið úr kanínu. Er tengt við Ijósvirkt prótein sem gefur grænan lit.
Cy3-conjugated Goat Anti-Mouse IgG 1:250 Binst sértækt við prímer mótefni úr mús. Er tengt við Ijósvirkt prótein sem gefur rauðan lit
Topro 3 1:1000 Binst tvíþátta DNA. Litar frumukjarna bláa.
Tafla 2
Prímer mótefni Þynning Eiginleikar
pSmad2 1:50 Binst fosfóruðu Smad2 sem tilheyrir TGF-(3 boðleiðinni
Idl 1:100 Smadl og Smad 5 bindast stýrli (promoter) Idl gensins
a-actinin 1:800 Binst hjartavöðvafrumum sérhæft
Tafla 3
118 Læknaneminn 2007