Læknablaðið - 15.05.1991, Side 53

LÆKNABLAÐIÐ
209
VÍSBENDING UM DÍSÚLFÍÐTENGI MILLI a OG
/3 EININGA FRJÓSEMISHORMÓNSINS EQUINE
CHORIONIC GÓNADÓTRÓPIN (eCG)
Höfundar: Hörður Kristjánsson, SigurÖur Ingvarsson.
Lífefnafræðistofa læknadeildar Háskóla Islands, 2.
ÍSTEKA hf.
Fínhreinsað eCG var leyst upp í 10 M urea og látið
standa í tvær klukkustundir við 37°C til að losa a og
P einingamar frá hvor annarri. Sýnið var síðan sett á
FPLC Mono-Q-jónskiptasúlu til að aðskilja einingamar.
Þá komu fram nokkrir toppar, sem allir innihéldu báðar
einingamar.
Fínhreinsað eCG var rafdregið í SDS rafdrætti með og án
/3-merkaptóetanóls. I ljós kom að án /3-merkaptóetanóls
losnuðu a og /3 einingamar ekki í sundur í rafdrættinum.
Fínhreinsað eCG var nú leyst upp r' 10 M urea með 1%
/3-merkaptóetanóli og látið standa við 37° C í tvær til þrjár
klukkustundir. Sýnið var sett á FPLC Mono-Q-súluna og
þá komu fram tveir toppar. Sá fyrri innihélt mikið af q
einingunni ásamt litlu magni af /3 einingunni. I seinni
toppnum var nær eingöngu /3 einingin. Þetta benti til
þess að a og /3 undireiningar eCG séu festar saman með
dísúlfíðtengi, sem rofnar fyrir tilstilli /3-merkaptóetanóls.
HREINSUN EQUINE CHORIONIC
GÓNADÓTRÓPINS f EINU SKREFI MEÐ
MÓTEFNAHREMMISKILJU
Höfundar: Hörður Kristjánsson, Hildw Björg Hróifsdóttir.
Lífefnafræðistofa læknadeildar Háskóla fslands. ISTEKA
hf.
Grófhreinsað equine Chorionic Gónadótrópin (eCG,
um 300 alþjóðaeiningar (IU)/mg prótein) og eCG r
blóðvökva (um 0.319 IU/mg prótein) var hreinsað með
hremmiskilju (affinity chromatography), sem byggði á
kyrrsettu fjölstofna mótefni gegn eCG. Hormónið bast við
hlutlaust sýmstig og losnaði við súrar aðstæður. f báðum
tilvikum reyndist hormónið mikið niðurbrotið samanborið
við eCG hreinsað með hefðbundnum súluskiljuaðferðum.
eCG úr blóðvökva virtist þó heldur minna niðurbrotið
en eCG úr grófhreinsuðu hormóni. Hreinsun hormónsins
á hremmiskiljunni var mjög mikil, um 100 föld í fyrra
tilvikinu og ríflega 4500 föld úr blóðvöka. Reynt var
að minnka niðurbrot eCG og auka heimtur með því að
losa hormónið af við hærra sýrustig (pH 3) og við 4°C.
Mestur hluti hormónsins losnaði við pH 3, en þó nokkuð
var enn bundið og losnaði af við lækkandi sýrustig.
Niðurstöður úr rafdrætti og mótefna »blotti« sýndu lítinn
sem engan mun á niðurbroti hormónsins hvort sem það
var losað við pH 3 eða pH 2.2.
NÝ AÐFERÐ TIL AÐ MÆLA GLÚTAÞfÓN
PEROXÍDASA
Höfundar: Baldur Símonarson, Guðný Eiríksdóttir.
Lífefnafræðistofa, Vatnsmýrarvegi 16
Virkni lífhvatans glútaþíón peroxídasa (GSH-Px) í blóði
hefur verið mæld til að kanna selenástand manna og
dýra, en snefilefnið selen (Se) er hluti af lífhvatanum.
Selenskortur hefur verið settur í samband við ýmsa
sjúkdóma, en niðurstöðum ber alls ekki saman um þetta.
Öft er erfitt að bera saman niðurstöður mismunandi
rannsókna vegna þess að mismunandi mælingaraðferðir
fyrir ensímið eru notaðar.
Við viljum því kynna hér nýja aðferð til að mæla ensímið
í blóði. Aðferðin byggir á notkun dímerkaptósúksfnats
sem er sérhæfður hindri fyrir ensímið.
Við teljum að aðferðin sé nákvæmari og auðveldari í
framkvæmd en þær mælingaraðferðir sem hafa verið mest
notaðar.
EINANGRUN PRÓTEINA MEÐ VATNSLEYSINNI
GRIPFJÖLLIÐU f ÖRSÍUNARKERFI
Höfundar: Kristmundur Sigmundsson, Hörður Filippusson.
Lífefnafræðistofa Háskóla íslands
Hæfileiki margra lífefna til að mynda sérhæfð tengsl
við önnur efni liggur til grundvallar ýmsum aðferðum
til einangrunar lífefnanna. Gripgreining á súlu (affinity
chromatography) er til dæmis algeng tækni, en þá er
griphópur festur á óleysið burðarefni. Vatnsleysnar
fjölliður má einnig nota sem burðarefni í gripgreiningu,
og er þá notuð örsíunartækni til að skilja fjölliðuna frá
smærri sameindum (affinity ultrafiltration).
Útbúið var gripgreiningarkerfi til einangrunar á trypsíni.
Kerfið samanstóð af vatnsleysinni gripfjölliðu, hvarfkeri,
dælu og örsfu. Griphópur fjölliðunnar var N-acryloyl-
m-aminobenzamidín, samkeppnishindri fyrir trypsín.
Kerfið var prófað með því að einangra trypsín úr lausn
sem einnig innihélt chymotrypsín. Bindigeta 0.7%
fjölliðulausnar /w/v) mældist um 8 mg/ml fyrir trypsín.
Óveruleg binding mældist fyrir chymotrypsrn. Eftir
útskolun á chymotrypsíni var trypsínið losað af kerfinu
með benzamidínlausn. Heimtur á trypsíni voru um 80%.
Til að kanna eiginleika og annmarka þessa kerfis var
gert af þvr' stærðfræðilegt líkan. Líkanið sýndi góða
samsvörun við hegðun kerfisins við einangrun trypsíns
frá chymotrypsíni.
Kerfinu var beitt við einangrun trypsíns úr úrdrátlarlausn
úr lambabrisi og útkoma borin saman við spá sem
Iíkanið gaf. Niðurstöður sýndu viðunandi samsvörun
spágilda líkansins við mældan próteinstyrk í útskoli frá
gripörsíunarkerfinu.
SMÍÐI OG ATHUGANIR Á BYGGINGU
VATNSLEYSINNAR GRIPFJÖLLIÐU FYRIR
EINANGRUN Á TRYPSÍNI
Höfundar: Kristmundur Sigmundsson, Hörður Filippusson.
Lífefnafræðistofa Háskóla fslands
Markmið þessa verkefnis var smíði vatnsleysinnar
gripfjölliðu með sérhæfða bindigetu fyrir trypsín og sem
hentaði til notkunar r' örsíunarkerfi, til einangrunar á
trypsíni (affinity ultrafiltration system).
Smíðaður var griphópur fyrir trypsín, N-akryloyl-
m-amínóbenzamidín, sem hentar til innliðunar í
pólýakrýlamíð fjölliðu. Samfjölliðun þessa efnis við
akrýlamíð Ieiddi til myndunar fjölliðu með sérhæfða
bindigetu fyrir trypsín.
Fjölliðan var einangruð og hreinsuð í örsíunarkerfi með
síumörk 100.000 dalton og 300.000 dalton.
Hingað til hefur reynst erfitt að greina sambærilegar
fjölliður með tilliti til samsetningar. Var því leitast
við að greina stærð og samsetningu þessarar fjölliðu
með tiltækum aðferðum. Stærðardreifing var könnuð
með hlaupsíum. Reynt var að greina samsetningu með
litrófsmælingum og kjamsegulómun (NMR).
Gerð verður grein fyrir niðurstöðum þessara mælinga.