Læknablaðið : fylgirit - 01.12.1992, Side 77

LÆKNABLAÐIÐ/FYLGIRIT 22
73
V 20
Efnagreining
V-20 Jóhann G. Bjarnason
V-21 Jón Magnús Einarsson
V-22 Höröur Kristjánsson
V-23 Sigrún Hrafnsdóttir
V-24 Höröur Filippusson
V-25 Hörður Filippusson
IIREINVINNSLA ENSÍMSINS GLÚTAÞÍÓN-
PEROXÍDASA ÚR RAUÐUM BLÓÐFRUMUM
MEÐ GRIPGREININGARSÚLU TENGDRI VIÐ
HINDRANN L-PENISILLAMÍN.
Jóhann G. Biarnason. Baldur Sfmonarson.
Lífefnafræðistofu Háskóla fslands, Vatnsmýrarvegi 16,
101 Reykjavík.
Með gripgreiningu (affinity chromatography) er unnt
að bæta nýtni hreinsunarsicrefa lífsameinda, fækka
skrefum og auðvelda framkvæmd þeirra. Súlutengdir
ensímhindrar eru gagnlegir griphópar. Tilgangur
rannsóknarinnar er að hreinsa glútaþíónperoxídasa
(GSH-Px, EC 1.11.1.9) með gripgreiningu.
Lífrænar sýrur sem hafa þíólhóp í beta-stöðu miðað
við karboxýlhóp hindra virkni glútaþíónperoxídasa.
Penisillamín (p-merkaptóvalín) hefur slíka byggingu,
en hefur að auki amínóhóp sem unnt er að tengja við
súlu. Það er þvf álitlegt sem griphópur til þess að
hreinsa GSH-Px.
D- og L-handhverfur penisillamíns voru festar á
Sepharose 4 B tengdan við virkjaðan framlengingarm
(N-hýdroxýsúkksínimíð ester af 6-amínóhexansýru).
GSH-Px úr rauðum blóðfrumum var fyrst hluthreinsað
á DEAE-Sepharose-súlu. Hluthreinsað ensím var sett
á D- og L- penisillamínsúlur og próteinum sem bindast
ekki skolað út með 0,1 M kalíumfosfatbuffer, pH 8,0.
GSH-Px var skolað út með sama buffer, sem að auki
innihélt 50 mM glútaþíón og 0,5 M NaCl. Ensímvirkni
var mæld í ThermoMax örplötumæli og fylgzt með
brottnámi NADPH (hjálparensím: glútaþíónredúktasi).
I jónskiptaskrefinu fæst unt 50-föld hreinsun og
endurheimtur ensímvirkni eru um 60 %. Gripgreining
á L-penisillamínsúlu gefur 450-falda hreinsun og 90-
95 % endurheimtur. Skrefin tvö gefa saman 22.000-
falda hreinsun og 55-60 % endurheimtur. í öðrum
birtum aðferðum eru notuð 5-7 skref, hreinsun er um
5.000-föld og endurheimtur um 50 %.
Bindigeta L-penisillamínsúlu, sem er að rúmmáli 15-
20 ml, er um 150 pg af GSH-Px, en eftir að hafa verið
notuð um 40 sinnum minnkar hún niður í 80-100 pg.
Megnið af hluthreinsuðu ensi'mi fer hins vegar beint
gegnum D-penisillamínsúlu, og auk þess tapast
veruleg virkni, og telst D-penisillamínsúla ekki nothæf
til gripgreiningar. Báðar handhverfur penisillamíns
hindra virkni GSH-Px. Forvitnilegt er að einungis D-
penisillamín er notað sem lyf, t. d. við kopareitrun og
liðagigt. L-handhverfan veldur eitrunum.
Gripgreining glútaþíónperoxídasa á súlu tengdri við
L-penisillamín gefur hærri hreinsimargfeldi og
endurheimtur en fyrri aðferðir. Færri skref eru notuð.
Alyktað er að L-penisillamín sé gagnlegur griphópur til
þess að hreinvinna glútaþíónperoxídasa á sérhæfðan
og skilvirkan hátt.