Læknablaðið : fylgirit - 01.12.1992, Blaðsíða 79

LÆKNABLAÐIÐ/FYLGIRIT 22
75
_ - ELISA AÐFERÐIR TIL MÆLINGA Á MÓTEFNUM
GEGN BETA EITRI CLOSTRIDIUM PER-
FRINGENS, UNDIRTEGUNDUM B OG C.
Hörður Kristjánsson1,2, Signín Hrafnsdóttir2. Jón M.
Einarsson2 og Eggert Gunnarsson3.
1) ísteka hf., Suðurlandsbraut_22, Reykjavík;
2) Lífefnafræðistofa Háskóla íslands, Reykjavík;
3) Tilraunastöð Háskólan íslands í meinafræði, Keldur,
Reykjavfk.
ELISA aðferðirnar samanstóðu af samloku þar
sem neðsta lagið var beta eitrið, miðlagið var
mótefnasermi úr hestum eða staðal-mótefnasermi og
efsta lagið var kanínu mótefni gegn hesta
immunoglobulini G, tengt við piparrótarperoxidasa.
Þrjár aðferðir voru settar upp og var hreinleiki beta
eitursins eini munurinn á þeim.
I fyrstu aðferðinni, kölluð Anti-beta I, var beta
eitrið hreinsað úr WHO (Weybridge) beta staðli með
FPLC gelsíun. Önnur aðferðin (Anti-beta II) byggðist
á eitri sem var hreinsað úr bakteríurækt C. perfringens,
uodirtegund B, með sinkfingur-súlu og í þriðju
aðferðinni (Anti-beta III) var eitrið af sinkfingursúlunni
hreinsað áfram með FPLC gelsíun. Fylgst var með
hreinleika eitursins með SDS-PAGE og mótefna blolti.
Eftir FPLC gelsíun á beta staðlinum þekkti beta
mótefnasermi 5-6 mótefnavaka f eitursýninu (Anti-beta
I). Eftir sínkfingur-súluna (Anti-beta II) voru um það
bil 10 mótefnavakar greinanlegir og 2-3 eftir frekari
hreinsun (Anli-beta III).
Næmi Anti-beta I og II var svipað með mælisvið
frá u.þ.b. 0,05 til 0,5 IU/ml en í Anti-beta III var
næmið um það bil 5 falt minna. Gerður var
samanburður á aðferðunum Anti-beta I og II með
mælingu á mótefnavirkni f sermi 40 hesta, sem höfðu
verið bólusettir með óvirku eitri C. perfringens,
undirtegund B. Báðar þessar aðferðir reyndust
nothæfar við val á hestum sem framleiddu mikið af beta
mótefni.
24 HREINVINNSLA OG EIGINLEIKAR ESTERASA
ÚR LAMBALIFUR
Hörður Filippusson. Kristmundur Sigmundsson og Jón
M. Einarsson
Lífefnafræðistofu Háskóla íslands, Vatnsmýrarvegi 16,
101 Reykjavik
Karboxýlesterasar eru flokkaðir eftir hvarf-
efnissérhæfni og næmi fyrir hindrum í arýlesterasa (A-
esterasa) (EC 3.1.1.2) og aliesterasa (B-esterasa), en
þeir síðarnefndu skiptast í kólínesterasa (EC 3.1.1.7
and 3.1.1.8) og alífatíska karboxýlesterasa (EC
3.1.1.1). Karboxýlesterasar spendýra hafa verið taldir
eiga hlutverki að gegna í afeitrunarhvörfum í lifur en
nýlegar athuganir benda til hlutverks sem tengist
næringarástandi.
Esterasar eru í vaxandi mæli notaðir sem tæki
við sérhæfðar efnasmíðar og eru því áhugaverðir frá
sjónarhóli ensímtækni.
I þeim tilraunum sem hér er skýrt frá var reynt
að vinna og hreinsa arýl- og alífatíska karboxýlesterasa
úr lambalifur. Ensímin voru dregin út úr frosnum,
flögutættum vef í bufferlausn sem innihélt þvottaefni,
Triton X-100, 0,5%. Prótein úr útdráttarlausninni voru
felld með ammóníumsúlfaú og síðan aðskilin með
hlaupsíun á Sepahacryl S-300, jónaskiptakrómatgrafíu
á MonoQ Sepharósa og vatnsfælnikrómatógrafíu á
Phenyl Sepharósa. Virknistyrkur esterasa var mældur
með p-nítrófenýlasetat annars vegar og etýlvalerat hins
vegar sem hvarfefni, með og án eserínsúlfats sem er
sérhæfður kólínesterasahindri. Fylgst var með
hreinsuninni með rafdrætti (naítve-PAGE, SDS-PAGE
og hleðsluskilagreiningu, IEF). Rafdráttarhlaup voru
lituð fyrir próteinum með Coomassie litun eða
silfurlitun og fyrir ensímvirkni með p-naphthýlasetati
sem hvarfefni og Fast Garnet sem tengilitarefni.
Mólmassi var metinn út frá SDS-PAGE rafdrætti og
analýtiskri hlaupsíun á Superose 6 FPLC súlu.
Vinnslan leiddi til hreinnar afurðar og aðskiln-
aðar arýlesterasa frá alffatískum esterasa.
Hleðsluskila-greining sýnir 5 ísóensím arýlesterasa
með hleðsluskil á bilinu 4,90 til 5,30 og þriggja
ísóensíma alífatísks esterasa með hleðslukil 5,56 til
5,68. Mólmassa-mælingar benda til þess að alífatíski
esterasinn sé um 200 kD og sé líklega dimer þar sem
hvor monomer er gerður úr tveim undireiningum.
Frekari rannsókna er þörf til að skilgreina nánar
sameindaeiginleika og hvarfeiginleika þessara ensíma.