Læknablaðið - 01.12.2015, Blaðsíða 15

LÆKNAblaðið 2015/101 571
R A N N S Ó K N
Mynd 4. Æða- og þvagbelgshimnupróf. Hænufóstur voru meðhöndluð með hýdró-
kortisóni og einu af eftirfarandi prófefnum (hringskífur, 6 mm í þvermál): filterpappír­
skífu vættri í afjónuðu vatni (neikvætt viðmið), filterpappírsskífu vættri með 1 µg/mL
af VEGF (Jákvætt viðmið), affrumuðu roði vættu í afjónuðu vatni. (a) Í efri röðinni
sjást myndir af svæðinu á æða­ og þvagbelgshimnunni þar sem sýnin voru lögð á í upp-
hafi. Í neðri röðinni er mynd af sama svæði á æða­ og þvagbelgshimnunni eftir að sýnin
höfðu verið fjarlægð eftir 48 klukkustundir. (b) Súlurnar sýna hlutfallslega breytingu
á fjölda æðagreina eftir 48 klukkustundir. Einhliða fervikagreinin gaf til kynna að
það sé annars vegar marktækur munur á milli roðsins og neikvæða viðmiðsins og hins
vegar á milli jákvæða viðmiðsins og neikvæða viðmiðsins, einkennt með * (p≤0,05).
Skekkjumörkin sýna staðalskekkju meðaltala (n=3). (c) Súlurnar sýna hlutfallslega
breytingu á flatarmáli æða eftir 48 klukkustundir. Skekkjumörkin sýna staðalskekkju
meðaltala (n=3). Einhliða fervikagreining gaf til kynna að það sé marktækur munur á
milli neikvæða viðmiðsins og roðsins, einkennt með *(p≤0,05).
prófi (R&D Systems, Minneapolis, Bandaríkjunum). Munur milli
meðhöndlunar með roði og án var metinn með stúdents-T prófi og
marktækur munur táknaður með *: p≤0,05.
Æða­ og himnuþvagbelgspróf in vivo
Til að meta áhrif græðlingsins á æðamyndun in vivo var notað
æða- og þvagbelgshimnupróf í hænufóstri (chick chorioallantoic
membrane assay, chick CAM).22 Frjó hænuegg voru geymd í 7 daga
í hitaskáp og prófefnum komið fyrir á mælisvæði sem var skil-
greint með plastskífu fyrir innan gat á skurninni. Öll prófefni sem
sett voru á æða- og þvagbelgshimnuna voru fyrst sæfð með 96%
etanóli, sem innihélt einnig hýdrókortisón (2,5 mg/mL) (Sigma-
Aldrich) síðan leyft að þorna. Filterpappírsskífur (Sigma-Aldrich)
vættar með VEGF (1 μg/mL) (Thermo Fischer Scientific) í afjónuðu
vatni voru notaðar sem jákvætt viðmið, skífur vættar með afjónuðu
vatni sem neikvætt. Roðið var einnig vætt í afjónuðu vatni áður
en það var sett á æða-og þvagbelgshimnuna. Myndir voru teknar
með með víðsjá (Leica MZ7,5, Mayer Instruments, Houston, Banda-
ríkjunum) fyrir og eftir að prófefni voru sett á mælisvæði æða- og
þvagbelgshimnunnar. Eftir 48 klukkustundir í hitaskáp voru eggin
tekin út og prófefnin tekin af æða- og þvagbelgshimnunni. Teknar
voru myndir af mælisvæðinu sem prófefnin voru í snertingu við
(mynd 4a). Breyting á æðamyndun fyrir og eftir ísetningu próf-
efna var metin, annars vegar með því að telja æðagreinar innan
tiltekins stærðarbils (mynd 4b) og hins vegar með því að meta hlut-
fallslega breytingu á flatarmáli æða (mynd 4c). ImageJ var notað til
skerpa myndirnar til þess að auðvelda greinatalningu á æðum og
meta hlutfall flatarmáls æða á æða- og þvagbelgshimnunni.
Niðurstöður
Bygging græðlingsins opin og trefjótt
Til að greina byggingu affrumaða roðsins og athuga hvernig hún
hentar fyrir innvöxt frumna var stuðst við þrjár mismunandi
myndgreiningaraðferðir: rafeindasmásjá, ljóssmásjá og confocal-
smásjá. Rafeinda- og ljóssmásjármyndir af þverskurði roðsins
sýna að það er holótt en við jaðarinn er efnið þéttast (mynd 1a-c).
Engar frumur sjást á myndum teknum með rafeindasmásjá (mynd
1a-b) og engir kjarnar sjást í ljóssmásjá, sem gefur til kynna að allar
frumur hafi verið fjarlægðar úr roðinu (mynd 1c). Mynd tekin með
confocal-smásjá sýnir að roðið virðist vera byggt upp af þráðum
sem snúa hornrétt hverjir á aðra svipað og í ofnu klæði (mynd 1d).
Allar aðferðir við myndgreiningu voru framkvæmdar að minnsta
kosti þrisvar (n=3).
Græðlingurinn er skaðlaus
Eftirfarandi próf á vefjasamrýmanleika græðlingsins voru fram-
kvæmd af óháðum aðilum undir stöðluðum aðstæðum (tafla I):
3-(4,5-ímetýlþíasól-2-ýl)-2,5-dífenýltetrasólíum-próf (MTT) gaf til
kynna að roðið hefði ekki marktæk áhrif á lifun frumna (MTT-próf,
tafla I). Niðurstöður minimum essential medium-prófs (MEM) gaf
til kynna að roðið hefði ekki sjáanleg áhrif á lögun frumna (MEM-
próf, tafla I). Þegar roðið var grætt í kanínuvöðva greindust engin
sjáanleg eitrunaráhrif en merki um vægt bólgusvar greindist í upp-
hafi (ígræðsla í vöðva, tafla I). Roðið hafði ekki áhrif á bólgusvar
í húð kanína (prófun á ertingu húðar, tafla I) og framkallaði ekki
ofnæmisviðbrögð í húð naggrísa (Buehler-próf, tafla I). Magn inn-
eiturs (endotoxin) í roðinu var mælt og reyndist vera innan viðmið-
unarmarka (inneiturspróf, tafla I). Uppleyst roð sem gefið var í æð
á tilraunadýrum reyndist hvorki vera eitrað í músum (vökvi í æð,
tafla I) né kanínum (sótthitapróf, tafla I). Hvað krabbameinsvald-
andi áhrif varðar hafði roðið ekki marktæk (p≤0,05) áhrif á tíðni
stökkbreytinga í bakteríum (Ames-próf, tafla I) og ekki sjáanleg
áhrif á form litninga í frumuræktun (litningafrávikspróf, tafla
I). Roðið hafði heldur ekki marktæk (p≤0,05) áhrif á aukningu
örkjarna við mergfrumuskiptingar í músum (örkjarnapróf, tafla
I). Engin eitrunaráhrif mældust þegar roðið var sett undir húð á
rottum í 90 daga (subchronic toxicity próf, tafla I). Niðurstöður
vefjasamrýmanleikaprófanna sýna að græðlingurinn er skaðlaus.
Græðlingurinn inniheldur kollagen I
Kollagen II er samsett úr þremur α1 (130 kDa) peptíðkeðjum,
kollagen I er samsett úr tveimur α1 peptíðkeðjum og einni α2 (115