Læknablaðið - 15.11.1990, Side 7

LÆKNABLAÐIÐ
433
I-----------------345 bp--------------------1
G-*-Á
10699 bp
I_______________________,
Apolipoprolein B gene (part of EXON 26)
PCO 1 5 ASO f
ASO 2
Figure 2. Position of the apo B (arg,500—>gln) mutation
in basepairs (bp), and relation of PCR primers
and ASO probes to the apo B gene. The two PCR
primers, PC01 and PC02, are 30 bases long
and are complementary to the (-) and (+) strands,
respectively.
PCO I: 5' GGAGCAAGTTGACCACAAGCTTAGCTTGGAA 3’
PCO 2: 5' CAGGGTGGCTTTGCTTGTATGTTCTCCGTT 3';
The two ASO probes, AS01 and AS02, are 13
bases long and span the site of the mutation (*)
AS01 identifies the normal apo B allele, AS02
identifies the mutant allele.
ASO I: 5’ GCACACGGTCTTC 3'
ASO 2: 5' GCACACA*GTCTTC 3'
-345bp
Figure 3. This figure shows the detection of 345
Bp fragment, amplified from the part of exon 26 in
the apo B gene containing nucleotide 10966. After
electrophoresis of 10/il of the PCR reaction volume
in 1% agarose and staining with ethidium bromide
the gel was viewed on UV transilluminator. The
marker M is a 1 kb ladder DNA. No. 1 is a sample
from the positive control whereas no. 2 and 3 are
from individuals, not having the mutation.
mín. og IV2 mín. við 72°C. Að því loknu
voru 10/zl af hvarflausninni rafdregnir í
eþidíum brómíð agarosa hlaupi og skoðað
undir útfjólubláu ljósi (mynd 3) til að athuga
hvemig til hefði tekist.
Notkun samsœtusértœkra þreifa (allele specific
oiigonucleotides, ASO): Langmest af DNA
frumunni er tvíþráða, þar sem þræðimir
eru undnir hvor um annan vegna pörunar
núkleótíða með vetnistengjum. Adenín (A)
parast þýmíni (T) og gúanín (G) parast
sýtósíni (C). Því nákvæmari sem samfellan
er, þeim mun sterkari verður bindingin
milli DNA þráðanna. Þetta er unnt að nýta
sér þegar þreifað er eftir ákveðinni DNA
röð. DNA sameindinni sem rannsaka á er
komið á einþráða form og þreifari sem er
samfallandi því DNA svæði sem greina á
er látinn bindast DNA þræðinum. Með því
að herða aðstæður við bindingu, t.d. með
auknu hitastigi eða minnkuðum saltstyrk,
þá brotna upp fleiri ósértækir bindingar.
Séu DNA þreifararnir nógu stuttir getur lítil
hitastigsbreyting ráðið hvort þreifarinn binst
eða dettur af þegar DNA röðin er frábrugðin í
einu eða fáum núkleótíðum. Þetta er forsenda
samsætusértækra þreifara (ASO) (1).
Til að greina stökkbreytingu í núkleótfði
10699 í apó-B geninu voru útbúnir tveir
samsætusértækir þreifarar, ASO 1: 5’
GCACACGGTCTTC 3’ sem er samfallandi
við eðlilega samsætu og ASO 2: 5’
GCACACA*GTCTTC 3’ sem er samfallandi
við stökkbreytta samsætu.
ASO voru geislamerktir á 5’ endann með
[7-32P] ATP (Amersham Intemational,
Amersham, U.K.) og T4 polynucleotide kinase
(BRL Ltd., Cambridge, U.K.). Sértæk virkni
(specific activity) var 0.1/rCi/pmol. Um 1/50
af PCR afurðinni voru fluttir yfir á Hybond-
N-síur (Amersham) með notkun sogtækis
(Schleicher & Schull, Dassel, F.R.G.). DNA
var bundið síum með útfjólubláu ljósi í 3
mínútur. Síurnar voru síðan meðhöndlaðar
nákvæmlega eins og lýst hefur verið (3).
Eftir bindingu ASO við DNA bútana við
35°C þá voru síurnar þvegnar við 40°C sem
var nægileg hitastigsbreyting til að brjóta
upp bindingu ASO og PCR bútanna þar sem
munurinn var eitt núkleótíð (sjá mynd 2).
NIÐURSTÖÐUR OG UMRÆÐA
Enginn þessara 95 innbyrðis óskyldu
íslensku einstaklinga reyndist hafa þessa
stökkbreytingu í apó-B geninu (apo-B,M<1 galli),
hvorki þeir 50 fulltrúar fjölskyldna sem hafa
ættgenga kólesterólhækkun í sermi né hinir