Læknablaðið - 01.12.2015, Page 14

570 LÆKNAblaðið 2015/101
ljómun við vissar bylgjulengdir, í þessu tilviki var roðið örvað með
488 nm ljósi (mynd 1d). Kjarnalitun (NucBlue, Life technologies)
var neikvæð.
Vefjasamrýmanleiki
Ýmis próf á lífsamrýmanleika roðsins voru framkvæmd af vott-
uðum rannsóknarstofum sérhæfðum í slíkum rannsóknum (Tox-
ikon, Massachusetts, Bandaríkjunum og Isotron Laboratories,
Tullamore, Írlandi). Vefjasamrýmanleikapróf eru eitt af fjölmörg-
um skilyrðum eftirlitsstofnana fyrir markaðsleyfum. Öll próf á
græðlingnum voru framkvæmd samkvæmt stöðlum Alþjóðlegu
staðlasamtakanna (International Organization for Standardiza-
tion, ISO) (tafla I).
Rafdráttur á pólýakrílamíðgeli
Til þess að greina bandvefsgerð roðsins var duftuðu roði blandað
við glúkósastuðpúðalausn (0,2 M Tris, 0,4 M NaCl, 0,4 M CaCl2
og 1 M glúkósi). Kollagenlausnir (Sigma-Aldrich, Missouri,
Bandaríkjunum) ásamt próteinkvarða (protein ladder) (Thermo
Fischer Scientific, Massachusetts, Bandaríkjunum) voru notaðar
sem stærðarviðmið. Kollagenlausnirnar innihéldu annaðhvort
kollagen I, einangrað úr rottuhala, eða kollagen II, einangrað úr
hænubrjóski. Öllum sýnum var blandað saman við hleðslulausn
(loading buffer) (62,5 mM Tris-HCl, 2% SDS, 10% glýseról, 5% 2-beta-
merkaftóetanól og 0,01% blátt brómófenól) í hlutföllunum 1:1 áður
R A N N S Ó K N
Mynd 2. Próteinrafdráttur á pólíakrýlamíðgeli. (a) Stærðarviðmið. (b) Kollagen I. (c)
Kollagen II. (d) Rafdráttarróf affrumaða roðsins einkennist af veiku bandi á bilinu 130­
115 kDa. (b-d) Aðalpróteinband roðsins er á stærðarbilinu 130­115 kDa og skarast við
kollagen I og að hluta til kollagen II (n=3).
Mynd 3. IL-6, IL-10, IL-12 og TNF-α voru mæld í floti einkjörnunga eða stórát­
frumna með Elísuprófi. THP­1 frumur voru ýmist ómeðhöndlaðar (48 klst., neikvætt
viðmið, gráar súlur), ræktaðar með affrumuðu roði án örvunar (48 klst.), for­örvaðar
með IFNγ (3 klst.) og svo örvaðar með LPS (48 klst., jákvætt viðmið, hvítar súlur) eða
örvaðar með IFNγ og LPS auk stoðefnis. Einnig voru THP-1 frumurnar þroskaðar yfir
í stórátfrumur með formeðhöndlun með PMA (48 klst.) auk örvunar með LPS (48 klst.,
svartar súlur) með og án roðs. Enginn marktækur munur var á seytingu frumuboð­
anna milli meðferðarhóps og viðmiðunarhóps fyrir hverja rækt fyrir sig. Skekkjumörkin
sýna staðalskekkju meðaltala 6 tilrauna (n = 6). *(p≤0,05)
en þeim var hlaðið á 15% pólýakrílamíðgel og þau rafdregin. Sýni
voru rafdregin við 4°C og 70 volt í rúmar 120 mínútur (mynd 2).
Bólguvakapróf
Einkjörnungafrumulína af gerð THP-1 var keypt frá DSMZ,
Leibnitz, Þýskalandi. THP-1 frumurnar voru ræktaðar í RPMI-
1640 frumuæti ásamt eftirfarandi íbætiefnum (Thermo Fischer
Scientific): pensillíni (100 U/mL) og streptómýsíni (100 μg/mL) og
hitaóvirkjuðu kálfasermi (10%). Einkjörnungum var sáð með þétt-
leikanum 5x105 frumur/cm2 í 24-holu bakka og ræktaðar í frumu-
ræktarskáp við 90% raka, 5% koltvíoxíð og 37°C. Frumur fengu
þrjár mismunandi meðferðir (mynd 3) með eða án roðs: enga
örvun, interferón gamma (IFNγ) (100 U/mL) og lípópólýsakkaríð
(LPS) (0,75 μg/mL) (Sigma-Aldrich), eða forból-12-mýristat-13-ase-
tat (PMA) (50 ng/mL) (Calbiochem, Darmstadt, Þýskalandi) ásamt
LPS (0,75 μg/mL). Einkjörnungar sem voru örvaðar fengu fyrst
IFNγ í þrjár klukkustundir og síðan hringskífu (1 cm2) af roði
ásamt LPS í 48 klukkustundir til viðbótar. Til að virkja einkjörn-
unga yfir í stórátfrumur fengu þær fyrst PMA í 48 klukkustundir.
Stórátfrumurnar voru síðan örvaðar með LPS í 48 klukkustundir,
með eða án hringskífu (1 cm2 = 0,024 g) af roði.21 Að lokum var
lífvænleiki frumurækta metinn með XTT (2,3-bis-(2-metoxý-4-
nítró-5-súlfófenýl)-2H-tetrasólíum-5-karbóxanilíð) prófi (Biotium,
Kaliforníu, Bandaríkjunum). Floti af frumuræktum var safnað og
styrkur Interleukin-10 (IL-10), Interleukin-6 (IL-6), Tumor Necrosis
Factor-alfa (TNFα) og Interleukin-12 (IL-12p40) mælt með Elísu-