Læknablaðið - 15.11.1990, Page 6

432
LÆKNABLAÐIÐ
þ.e. með kólesterólútfellingar í sinar og
mikla kólesterólhækkun í sermi. Þessum
ættum hefur verið lýst annars staðar (6).
Jafnframt voru athuguð DNA sýni 30 óskyldra
einstaklinga með hátt kólesteról í sermi (allir
vel fyrir ofan 95. percentil) en allir með
eðlilega þríglýseríðaþéttni í blóði (flokkur
Ila). Allir þessir einstaklingar áttu einnig
ættmenni með hækkaða blóðfitu en enginn
hafði kólesterólútfellingar í sinar sem notað
var til aðgreiningar frá áðumefndum FH
einstaklingum. Einnig voru rannsakaðir 45
einstaklingar með kólesterólþéttni >7.0
mmól/1 úr 175 einstaklinga hópi sem kom
á rannsóknarstöð Hjartavemdar sem hluti af
tilviljunarkenndu úrtaki (MONICA rannsókn,
25-65 ára).
AÐFERÐIR
DNA einangrun: 10 ml af heilblóði vom
teknir í glös með EDTA og geymdir við -
- 20°C uns DNA var einangrað úr hvítum
blóðkomum með aðferð sem byggir á
sprengingu fruma, einangrun kjarna og
fenól/klóróform útdrætti á DNA (7).
Ensímhvött fjölföldun DNA (polymerase
chain reaction, PCR): Þegar fruma
tvöfaldar sitt DNA þá notar hún til þess
DNA fjölliðunarensím (polymerase)
sem binst einþráða DNA þar sem DNA
helixinn hefur undist niður og opnast
upp. Til þess að ensímið verki þarf stutta
núkleótíðbúta, vísa (primers), sem verka sem
upphafsaflestrarstaður fyrir ensímið sem svo
myndar nýjan DNA þráð í 5’-3’ átt. Þetta
er sú grundvallarregla sem menn hafa nýtt
sér í fjölföldun á DNA í tilraunaglasi, in
vitro (mynd 1). Með vali á vísum er unnt
að stýra hvar fjölföldunin verður. Útbúnir
eru tveir stuttir vísar 20-30 núkleótíðar sem
eru samfallandi við núkleótfðaröð í DNA
sameindinni sitt hvorum megin við það svæði
sem á að fjölfalda hverju sinni og bindast
því þar og verka sem upphafsaflestrarstaðir
fyrir DNA fjölliðunarensímið sem er haft í
hvarflausninni (2).
Upphafsskrefið verður því að eðlissvipta DNA
sameindina sem fjölfalda á með hitun í 92°C-
95°C. Síðan er lausnin kæld, venjulega í
kringum 55°C svo að vísarnir bindist hinu
einþráða DNA. Þá er hitinn hækkaður á ný,
nú í kringum 70°C þar sem fjölliðunarensímið
nýmyndar DNA eftir því DNA sem fyrir er.
Native | 3’

DNA " 1 5
Heath denaturation
1 Cycle 1

Primer annealing Primer 2 5 trirrr* 3 3'"”5' Primer 1
1
Primer 3' - J J
New DNA New DNA
extension C 1 3’

Cycle 2

1
Cycle 2+N
Figure 1. The polymerase chain reaction cycle
consists of three steps performed at different
temperatures. First the double stranded DNA is
denatured into single strands. By lowering the
temperature the oligonucleotide primers anneale
to each single strand and then the polymerase
adds on nucleotides, generating a new DNA strand.
By repeating the cycles, more and more DNA is
generated to act as templates for ensuing cycles,
increasing the DNA concentration expontentially. The
DNA consists mainly of short products between the
primers giving single band on electrophoresis.
Þetta er svo endurtekið, venjulega í kringum
30 sinnum. Eftir hvem hring höfum við tvöfalt
fleiri mót til aflestrar, þ.e. ef byrjað er með
100 eintök af einhverju DNA þá höfum við
200 eftir fyrsta hring, 400 eftir næsta og
þannig koll af kolli. Þannig er fjölföldunin
veldisfall (exponential). Þó að nýtnin sé
sjaldnast meiri en 80% þá gefur það auga leið
að verulegt magn af DNA fæst til rannsókna
,með þessari aðferð. Með notkun hitaþolins
fjölliðunarensíms (Taq polymerase unninn
frá Thermus aquaticus) hefur verið unnt að
tæknivæða efnahvarfið og fá milljónfalt magn
á nokkrum klukkustundum. I þessari rannsókn
voru tveir vísar notaðir til að stýra fjölföldun
á 345 basaparabút frá tjáningarröð (exon)
26 í apó-B geninu sem spannar svæðið sem
inniheldur núkleótíð 10699 en þar er umrædd
stökkbreyting í geninu (mynd 2).
PCR var framkvæmd 30 sinnum í
forritunarlegu hitabaði (Cambio Intelligent
Heating Block) við 95°C í 'h mín., 55°C 1