Freyr - 15.12.2004, Síða 36

Skimun fyrir ofnæmisvakagenum
í genasafni úr Culicoides
hvati
Einangrun á mRNA úr flugum ----------> cDNA -------------> PCR með handahófs vísum
-----► bútar settir á tjáningafeijur--------> genabútar tjáðir í bakteríum ------->
bakteríu þyrpingar ræktaðar --------> þyrpingar skimaðar með sermi úr SE hesti
Mynd 3. Skimun fyrir ofnæmisvakagenum i genasafni úr Culicoides.
Einungis þyrpingar eða bönd í
hlaupi sem binda IgE úr serminu
eru áhugaverð (mynd 3).
Tjáning og framleiðsla
OFNÆMISVAKA
Gen ýmissa ofnæmisvalda í
fólki hafa verið klónuð og endur-
röðuð prótín verið framleidd, s.s.
úr birkifrjói (14), myglusveppum
(15), köttum (16), moskítóflugum
(13), æðvængjum (17) og fleiri
tegundum (5). Við tjáningu vak-
anna er mikilvægt að endurröðuð
prótín séu brotin saman með
brennisteinsbrúm á réttan hátt og
hafí rétta sykrun eða fitun. Sér-
staklega á þetta við um prótín-
vaka, sem eru ekki samfelldir,
eins og flestir vakar sem IgE
binst. Endurröðuð prótín hafa ver-
ið tjáð í mismunandi tjáningar-
kerfum, jafnt í dreifkjömungum
og heilkjörnungum. Algengustu
tjáningarkerfm eru í bakteríum,
t.d. E. coli. Slík kerfí eru auðveld
í notkun og með mikla fram-
leiðslugetu. Helsti galli prótín-
framleiðslu í E. coli er að engin
sykrun er í dreifkjömungum og að
offramleiðsla á prótínum getur
leitt til þess að þau em ekki rétt
brotin saman og myndast geta
óuppleysanlegir prótínkleggjar
með enga líffræðilega virkni (18-
20).
Gersveppa-, skordýra-, plöntu-
og spendýrafrumur eru dæmi um
tjáningarkerfi í heilkjömungum.
Þar sem við viljum tjá gen úr
skordýri liggur beinast við að nota
tjáningarkerfi í skordýrafmmum.
Baculoveirutjáningakerfi er mest
notaða skordýrafrumukerfið en
það byggir á baculoveimm sem
ræktaðar em í skordýrafmmum
(mynd 4). Baculoveimr em stórar
tveggja þátta DNA skordýraveir-
ur. Erfðaefni þeirra er ljölfaldað
og umritað í kjama hýsilfmmu,
veiru-DNAinu er pakkað í sta-
flaga hylki. Stærð hylkjanna er
mjög breytileg og þau geta því
rúmað mikið utanaðkomandi
DNA. Við fjölgun á villigerð bac-
uloveiru em fyrri og seinni fasi. I
fyrri fasa losa fmmumar veiru-
agnir sem knappskjótast út úr
frumunum. í seinni fasa myndast
“hindraðar” (occluded) agnir sem
safnast fyrir í kjama í miklum
mæli, em 40-50% af heildarprót-
ínum sýktu fmmanna og gera það
að verkum að kerfið hentar vel
fyrir tjáningu á utanaðkomandi
prótínum (21).
Ymsar leiðir em til að koma
geninu, sem á að tjá, inn í baculo-
veiruna. Þar sem baculoveimg-
enomið er stórt þá er erfítt að setja
gen beint inn á það. Við notum
svokallað Bac-to-Bac kerfí þar
sem notaður er sérstakur E.coli
stofn (DHlOBac E.coli) sem inni-
heldur baculoveim DNA, kallað
bacmid. Genið, sem á að tjá, er
fyrst sett á flutningsferju. Flutn-
ingsferjan með geninu er síðan
sett inn í DHlOBac E.coli og gen-
ið af flutningsferjunni endurraðast
inn bacmiðið í bakteríunum. Síð-
an er gerð genainnleiðsla á skor-
dýrafrumunum og í þeim verður
veirufjölgun og uppsöfnun á end-
urröðuðu prótíni. Endurraðaðar
veirur eru svo notaðar til áfram-
haldandi sýkingar á fmmum og
framleiðslu prótína (mynd 4).
Baculoveirukerfíð er mjög nyt-
hátt og hentar vel fyrir tjáningu á
prótínum úr skordýmm þar sem
sykmn og önnur meðhöndlun á
þeim eftir þýðingu ætti að líkjast
því sem er í lífvemnni sjálffi. Of-
næmisprótín úr skordýmm hafa
verið framleidd i baculoveimkerfí
með góðum árangri, þau hafa
bundið IgE og sýnt sömu virkni
og uppmnalegu próteinin (18, 20,
22).
Ofnæmisvakar í Culicoides
MÝFLUGUNNI
Við höfum einangrað tvö gen úr
Culicoides nubeculosus sem mögu-
lega skrá fyrir ofnæmisvökum.
Annað þessara gena er rCul n 1
genið sem er 237 basapör og hefúr
67-78% samsvömn í amínósýru-
röð við P0 ribosomal prótín hjá
öðmm tvívængjum en 57% sam-
svömn við ribosomal prótein P0
myglusvepps (rAsp f 8). Tengsl
ribósómal prótína við ofnæmi í
136 ■ Freyr 11 -12/2004