Læknablaðið - 15.05.1998, Page 13

LÆKNABLAÐIÐ 1998; 84
375
0,9% NaCl lausn og 50 IU/ml heparín. Blóð-
sýni til deilitalningar var tekið í EDTA glös.
Fengið var leyfi siðanefndar Landspítalans fyr-
ir söfnun naflastrengsblóðsins og blóðið ótengt
persónum.
Einangrun einkjarna hvítfrumna: Ein-
kjarna hvítfrumur voru einangraðar með ísó-
paque/fícoll (I/F) (19) við 800 G í 15 mínútur,
þvegnar þrisvar sinnum með Hanks Basal Salt
Solution (HBSS) og taldar eftir litun með
metýl fjólubláu.
CD34 Iitun og greining í frumuflæðisjá:
Hlutfall CD34+ frumna var metið í FACScan
frumuflæðisjá (Becton Dickinson, USA) eftir
merkingu með einstofna mótefnum. Frumu-
lausn var höfð í 30 mínútur á ís með flúor-
escein ísóthíócýanati (FITC, grænt) og phýkó-
erýtrín (PE, rautt) merktum einstofna músa-
mótefnum gegn CD34 (HPCA-2, Becton Dick-
inson, USA) og CD45 (T29/33, Dako A/S,
Denmark). PE merkt Músa IgGl (Becton Dick-
inson, USA) var notað sem neikvætt viðmið.
Að mótefnabindingu lokinni voru rauðfrumur
sprengdar með rofbuffer (Becton Dickinson
Lysis Buffer), frumur þvegnar tvisvar sinnum
með PBS (pH 7,4) og að lokum fixeraður í
0,9% NaCl með 0,5% formalíni. Gerðar voru
tvennskonar litanir: a) CD45 FITC/IgGl PE, b)
CD45 FITC/CD34 PE og 50.000 frumum safn-
að (24). Eingöngu voru skoðaðar CD45+ frum-
ur (allar hvítfrumur) og reiknað hlutfall CD34+
frumna af CD45+ frumum.
Klónógenískar ræktir: Mat á fjölda kólón-
íumyndandi frumna var gert í tvenns konar
ræktunaræti. Annars vegar var um að ræða
metýlsellulósa (StemCell Technologies,
Vancouver, Canada) til ræktunar á rauð-
frumukólóníum (burst-forming unit-erythroid,
BFU-E) (20) og hins vegar agar til ræktunar á
hvítfrumukólóníum (colony-forming unit-
granulocyte, macrophage, CFU-GM) (21).
Metýlsellulósaætið innihélt kálfasermi (30%),
BSA (1%), 2-merkaptóetanól (10 JM), L-glú-
tamín (2mM) og vaxtarþættina rhSCF (50
ng/ml), rhGM-CSF (10 ng/ml), rhIL-3 (10
ng/ml) og rhErýtrópoietín (3U/ml). Agarætið
innhélt agar (Bacto Agar, Difco) kálfasermi
(9%), rhSCF (50 ng/ml) (R&D Systems, Minn-
eapolis, USA), rhIL-3 (10 ng/ml) (R&D Sy-
stems, Minneapolis, USA) og rhGM-CSF (7
ng/ml) (SandozPharma AG, Basel, Sviss).
Frumulausn var blandað við metýlsellulósann
annars vegar og agarinn hins vegar, sett í
35mm petrískálar og inkúberuð í hitaskáp við
37°C, 5%CO: og 100% raka í 14 daga. Að þeim
tíma liðnum voru BFU-E og CFU-GM kólóní-
ur taldar í öfugri (inverted) smásjá. Kólóníur
voru alltaf taldar af tveimur rannsóknarmönn-
um. Niðurstöður beggja voru skráðar og mis-
munur milli þeirra var aldrei meiri en 10%
(niðurstöður ekki sýndar).
Frysting í fljótandi N:: Hluti einkjarna hvít-
frumna var frystur niður og líftala og kólóníu-
vöxtur fyrir og eftir frystingu borinn saman
(n=19). Frystivökvinn var samsettur úr dímetýl
súlfoxíði (DMSO) (20%), kálfasermi (50%) og
Iscoves Modified Dulbeccos Medium (IMDM)
(30%). Jafnmiklu rúmmáli af frumulausn og
frystivökva var blandað saman þannig að loka-
styrkur DMSO var 10%. Sýnin voru fryst við
-80°C (Kelvinator, Manitowoc, USA) í sólar-
hring áður en þau voru flutt í fljótandi N:.
Frumustyrkur við frystingu var hafður á bilinu
5-1 Ox 106 frumur/ml (22).
Þíðing frystra sýna: Eftir þriggja til fjög-
urra vikna geymslu í fljótandi N: voru sýnin
tekin upp og þídd í 37°C heitu vatnsbaði. Strax
eftir þíðingu voru frumurnar þvegnar í HBSS
(þrisvar sinnum) og líftala þeirra metin með
akridín orange/ethidfum brómíð litun. Kólóníu-
ræktun var gerð á þíddum sýnum eins og áður
hefur verið lýst.
Einangrun CD34+ frumna: Til að koma í
veg fyrir mengun af völdum B-frumna voru
þær hreinsaðar burt (neikvætt val) með segul-
kúlum, húðuðum músamótefnum gegn CD19
(Dynal, Oslo, Norway). Frumulausnin var
inkúberuð með kúlunum, við 4°C og vægan
velting, í 30 mínútur og CDI9+ frumur dregn-
ar út nteð segli. CD34+ frumur voru síðan ein-
angraðar úr þeirri frumulausn sem eftir stóð
með segulkúlum, húðuðum einstofna músa-
mótefnum gegn CD34 (Dynal, Oslo, Norway)
(jákvætt val) við 4°C og vægan velting í 45
mínútur. Að þeim tíma liðnum voru CD34+
frumur dregnar út með segli og kúlurnar losað-
ar frá frumunum með DETACHaBEAD
(Dynal, Oslo, Norway). Hlutfall CD34+
frumna var metið fyrir og eftir einangrun með
segulkúlum með frumuflæðisjárgreiningu.
Tölfræðileg úrvinnsla: Samanburður á
kólóníufjölda fyrir og eftir frystingu í fljótandi
köfnunarefni var gerður með pöruðu t-prófi
eftir lógaritmíska umbreytingu. Notað var for-
ritið StatView 4.51. Marktækur munur var sett-
ur við p<0,05.