Læknablaðið - 15.03.2000, Blaðsíða 14

FRÆÐIGREINAR / ERFÐAGREINING
lega skyldra prótína sem kallaður hefur verið kjarna-
viðtækjafjölskyldan (nuclear receptor superfamily)
(7-11). Af þeim fjölda prótína sem tilheyra þessari
fjölskyldu má nefna sykurstera-, estrógen-, D-víta-
mín-, A-vítamín- og skjalkirtilshormónviðtækið.
Skipta má andrógenviðtækinu og skyldum prótínum
upp í fjóra byggingarhluta (12,13). Peir eru: 1) amínó-
endi sem ber þann hluta viðtækisins sem miðlar örv-
un á genaafskrift, 2) DNA bindisvæði sem inniheldur
tvo svokallaða sínkfingur og þekkir sérstakar raðir í
prómóter svæði gena, 3) hjararhluti sem ber markröð
fyrir frumukjarna (nuclear targeting signal) og 4)
sterabindistaður sem bindur andrógen. Þegar andró-
gensteri hefur bundist viðtæki sínu í umfrymi verða
breytingar í byggingu viðtækisins, sem valda því að
það berst inn í kjarna frumunnar. Þar binst viðtakinn
ákveðnum niturbasaröðum í prómóter svæði útval-
inna gena og hefur áhrif á tjáningu þeirra.
í gagnagrunni yfir allar stökkbreytingar, sem hafa
fundist í andrógenviðtækinu (netfang http://www.
mcgill.ca/androgendb/) er lýst rúmlega 300 mismun-
andi stökkbreytingum (14). Þessar stökkbreytingar
eru af ýmsum gerðum og valda mismiklum klínískum
einkennum eftir því hve mikil áhrif þær hafa á lífefna-
fræðilega virkni viðtækisins (1,2). I þessari rannsókn
er íslenskri fjölskyldu lýst, þar sem fundist hafa tvær
stúlkur með litningagerðina 46, XY og klínísk ein-
kenni algjörs andrógenónæmis. Gerð var leit að
stökkbreytingum í geni andrógenviðtækis stúlknanna
og nánustu ættingjar voru einnig rannsakaðir.
Efniviður og adferðir
Úrtak: Blóðsýni voru tekin úr tveimur systradætrum
sem höfðu litningagerðina 46, XY og höfðu greinst
með klínísk einkenni andrógenónæmis. Sýni voru
einnig tekin úr mæðrum þeirra, mæðrasystrum, móð-
urömmu og ömmusystrum. Erfðaefnið var einangrað
úr hvítum blóðkomum eins og áður hefur verið lýst
(15) . Rannsóknin var gerð með upplýstu samþykki
allra þátttakenda. Vísindasiðanefnd Sjúkrahúss
Reykjavíkur og Tölvunefnd gerðu ekki athugasemd
við birtingu niðurstaðna.
Fjölliðimarhvörf: Gerð var leit að stökkbreyting-
um í geni andrógenviðtækis hjá stúlkunum tveimur
með AIS. Allar átta útraðirnar í geni andrógenvið-
tækisins voru fjölfaldaðar með því að nota 14 pör
fákirna, en niturbasaröð þeirra hefur áður verið lýst
(16) . Annað fákirnanna í þessum 14 pörum var merkt
með bíótíni í 5'-enda.
SSCP rannsókn: Svokölluð SSCP aðferð (single-
stranded conformation polymorphism) var notuð til
að finna stökkbreytingu í fjölfölduðum DNA bútum
úr geni andrógenviðtækisins (16,17). Bútarnir voru
rannsakaðir með því að blanda þremur uL af hverri
fjölliðunarblöndu við þrjá pL af hleðslustuðpúða
(95% formamíð, 20 mM EDTA, 0,05% brómófenól
blátt og 0,05% xýlen cýanól). Blandan var hituð við
100°C í fimm mínútur og síðan snöggkæld á ís.
Tveimur pL af sýnunum var hlaðið á 20% einsleitt
PHAST pólýakrflamíð gel (Amersham Pharmacia
Biotech). Fyrir hleðslu sýna voru gelin undirbúin
með 10 meðalvolttímum við 5 mA, 1 W og 400 V.
Sýnin voru fyrst rafdregin í tvo meðalvolttíma við 5
mA, 1 W og 25 V og síðan 450 meðalvolttíma við 5
mA, 1 W, og 400 V. Eftir rafdrátt voru DNA bútar í
polýakrflamíð geli gerðir sýnilegir með silfurlitun.
DNA niturbasaraðgreining: Sú útröð andrógen-
viðtækis, sem gaf óeðlilegt SSCP mynstur við rafdrátt
(niðurstöður ekki sýndar), var rannsökuð frekar með
niturbasaraðgreiningu. Fyrir raðgreininguna voru
DNA-bútar hreinsaðir úr fjölliðunarblöndum með
QIAquick PCR Purification Kit frá Qiagen. Ein-
strengja DNA-bútar voru síðan einangraðir með
notkun á Dynabeads M-250 streptavidín (Dynal) og
Dynal segli. Þessir bútar voru síðan raðgreindir sam-
kvæmt aðferð Sangers með Sequenase™ Kit útgáfa
2.0 (USB), [a-15S]-dATP og þeim fákimum, sem not-
uð voru til að fjölfalda viðkomandi útröð.
Arfgerðargreining: Sérstök aðferð til arfgerðar-
greiningar á R752Q samsætunni var þróuð, sem
byggir á fjölliðunarhvarfi og skerðibútabreytileika.
Tvö hundruð og níutíu basapara (bp) kjamsýrubútur,
sem inniheldur útröð 5 í geni viðtækisins, var fjöl-
faldaður í fjölliðunarhvarfi með hjálp fákimanna 5'-
CAACCCGTCAGTAGTACCCAGACTGACC-3'
og 5'-AGCTTCACTGTCACCCCATCACCATC-3'
og voru 40 hringir endurteknir við hitastigin 93°C,
63°C og 72°C. Tveimur einingum af skerðiensíminu
5fluIIIA var síðan blandað við 10 pL af fjölliðunar-
blöndu og skerðibútabreytileiki greindur með raf-
drætti í 4% agarósu geli. Rannsókn á einstaklingum
með eðlilega samsætu andrógenviðtækis gefur skerði-
búta sem eru 139,107 og 44 bp að lengd, á einstak-
lingum, sem eru arfblendnir með tilliti til R752Q sam-
sætunnar, 183, 139, 107 og 44 bp; og hjá arfstökum
(hemizygous) einstaklingum með tilliti til R752Q
samætunnar, 183 og 107 bp.
Niðurstöður
Við fjölföldun og SSCP rannsókn á útröðum í geni
andrógenviðtækis kom fram erfðabreytileiki í útröð 5
hjá stúlkunum tveimur með AIS (niðurstöður ekki
sýndar). Aðrar útraðir gensins gáfu ekki merki um
breytileika. Niturbasaröð útraðar 5 í geni andrógen-
viðtækis stúlknanna var ákvörðuð og fundust basa-
skiptastökkbreyting í amínósýrukóða 752 (mynd 1).
Þar sem eðlilegur einstaklingur hefur röðina CGA
var röðin CAA hjá stúlkunum. Samkvæmt erfðalykli
(genetic code) hafa þessi basaskipti í för með sér að í
stað argeníns í stöðu 752 í fjölpeptíðkeðju andrógen-
viðtækisins kemur amínósýran glútamín (R752Q).
Þessi amínósýra er staðsett í sterabindistað viðtækis-
ins (mynd 2). Stökkbreytingunni R752Q í andrógen-
viðtækinu hefur einu sinni áður verið lýst, en það var
164 Læknablaðið 2000/86