Læknaneminn - 01.04.2016, Page 35

Ri
trý
nt
e
fn
i
35
Fyrst er myndaður 33 basapara fleygur úr
utanað komandi erfðaefni (e. protospacer) á
óþekktan hátt og því næst innlima Cas1 og
Cas2 prót einin í sameiningu fleyginn inn í
CRISPR genasætið12.
Martin Jinek og samstarfsfólk sýndu fram
á að hlutverk Cas9 úr S. pyogenes væri að
framkvæma tvíþátta brot í röðinni sem
crRNA ber kennsl á og jafnframt að
tracrRNA væri nauðsynlegt til að brot ætti
sér stað. Sá hluti tracrRNA sem ekki binst
crRNA er mikilvægur í bindingu RNA
sameindarinnar við Cas913.
PAM röð (e. protospacer adjacent motif) er í
fram haldi af mótsvarandi röð crRNA í erfða-
menginu. Hún er ekki til staðar í crRNA
sameindinni sjálfri heldur er hún varðveitt
mynstur í utanaðkomandi erfðaefninu. PAM
röðin er nauðsynleg fyrir bakteríuna til að
gera greinarmun á utanaðkomandi erfðaefni
og sínu eigin erfðaefni í CRISPR genasætinu
þar sem utanað komandi erfðaefni við kom-
andi bakteríu veiru hefur verið afritað13. Enn
er ekki vitað með hvaða hætti PAM röðin er
fjarlægð við inn limun fleygs í CRISPR gena-
sætið12. Cas9 klippir DNA röðina sem er
mót svarandi við crRNA, þremur núkleó tíðum
frá PAM röðinni. Sam svarandi þáttur (e. non­
comple mentary) er klipptur 3-8 núkleo tíðum
frá PAM röð (mynd 1)13. Í S. pyogenes er PAM
röðin NGG það er tvö gúanín núkleótíð í
röð einu basapari frá röðinni sem crRNA
parast við. Þessi röð virðist vera nauðsynleg
í skurði Cas9 og fjarvera hennar minnkar
sækni Cas9-RNA flókans í skot mark sitt
í erfða menginu13. Það er nauðsynlegt til
þess að hann klippi ekki ofangreint afrit af
veiruerfðaefninu í sínu eigin erfðefni, heldur
aðeins erfðaefni veirunnar sjálfrar sem
inniheldur PAM röðina.
Í kjölfarið þróuðu Martin Jinek og sam-
starfs fólk tilbúið RNA sem býr yfir sömu
eiginleikum og RNA hluti Cas9-RNA
flókans. Það líkist styttum útgáfum af
tracrRNA og crRNA sem er skeytt saman á
3‘ enda crRNA og 5‘ enda tracrRNA. Þessa
tilbúnu sameind kölluðu þeir guide RNA
eða leiðsögu-RNA (mynd 1). Slíkt leið-
sögu-RNA er unnt að búa til á þann hátt
að rannsak andinn getur valið bindi stað þess
í erfða menginu með því að breyta hlutanum
sem samsvarar crRNA og þar með beint Cas9
á hvern þann stað sem honum hugnast svo
framar lega sem aðlæg PAM röð sé til staðar.
Í kjölfarið útbjó sami rannsóknar hópur RNA
ætluð til erfða breytinga í manna frumum
sem kall aðist single­guide RNA eða sgRNA.
Gena ferjur, sem skrá fyrir Cas9 og sgRNA,
voru leiddar (e. transfection) í manna frumur
í rækt14. Frumur nar fara þá að tjá erfða-
efni plasmíð sins og þar með Cas9 prótínið
og við eigandi sgRNA. Hópnum tókst að
nota að ferðina til að skera í CLTA genið og
koma af stað DNA viðgerð með ósamstæðri
endaskeytingu (NHEJ-viðgerð, e. non­
homologous end joining). Í þessu tilfelli var
hlutfall stökkbreytinga í kjölfar ófullkom-
innar NHEJ-viðgerðar um 6-8% sem er
sam bærilegt við aðrar aðferðir notaðar við
erfða breytingar líkt og TALEN (transcription
acti vator­like effectors nucleases) og ZFN
(e. designer zinc fingers). Þeim tókst því að
sýna fram á að hægt væri að nýta þessa
fornu varnar aðferð baktería til að erfða breyta
manna frumum14. Þetta voru mikil tíma mót
því þó að hlutfall stökkbreytinga væri svipað
og með fyrri aðferðum er CRISPR aðferðin
mun einfaldari og auðveldari í fram kvæmd14.
Jafnframt er skilvirknin mun hærri en 6-8%
í dag15. Á nánast sama tíma sýndi annar
hópur að ekki einungis væri hægt að nota
CRISPR aðferðina til að framkvæma eina
erfðabreytingu heldur að hægt er að innleiða
fleiri en eitt leiðsögu-RNA og framkvæma
margar stökkbreytingar í einu16.
Eftir að Cas9 hefur klippt í erfðaefnið (mynd
1) tekur við viðgerðarferli innan frum-
unnar. Annað hvort er ófullkomin viðgerð
framkvæmd þar sem tvíþátta endum DNA
er skeytt saman og hluti núkleo tíðanna
glatast (NHEJ-viðgerð) eða þar sem gert er
við brotið með samstæðri endur röðunar-
viðgerð (HR-viðgerð, e. homo logous recombi­
nation). Mun algengara er að manna frumur
noti NHEJ-viðgerð við tvíþátta brot en HR-
viðgerð17. Í NHEJ-viðgerðar ferlinu getur
átt sér stað ýmist úr felling eða inn setning
núkleó tíða sem meðal annars getur valdið
lesramma hliðrun (e. frame shift mutation) og
þannig óvirkjað prótein sem viðkom andi gen
skráir fyrir. HR-viðgerðin er nákvæmari en
farið er eftir DNA sniðmóti við viðgerðina.
Snið mótið getur ýmist verið hannað af
vísinda mönnum (e. exogenous DNA sequence)
eða gen á systurlitningi notað sem mót (e.
endogenous DNA sequence). Systur litningur er
aðeins aðgengi legur sem sniðmót í S-fasa og
Mynd 1. Cas9 notar gRNA til að bera kennsl á réttan stað í markgeni. Cas9 binst leiðsögu­RNA (gRNA) og myndar Cas9­RNA flóka. Tuttugu núkleotíða röð gRNA
binst mótsvarandi röð í markgeni og Cas9 framkvæmir tvíþátta brot. Aðlægt við mótsvarandi röð gRNA er PAM (protospacer adjacent motif ) sem er mikilvæg fyrir
sækni Cas9­RNA flókans í skurðstað markgensins. Cas9 klippir mótsvarandi röð 3 núkleotíðum frá PAM en samsvarandi 3­8 núkleótíðum frá PAM 14.
(Myndahöfundar Brynjar Örnuson Guðnason, Aðalheiður Elín Lárusdóttir).