Læknaneminn - 01.04.2016, Page 36

Ri
trý
nt
e
fn
i
36
G2-fasa í frumu hringnum18. Sé um genagalla
að ræða má á þennan hátt gera við gen með
því að innleiða DNA-mót af heilbrigðu geni
ásamt Cas9/CRISPR.
Rannsókn frá 2013 komst að þeirri
niðurstöðu að Cas9 gæti skorið í bindistað
leiðsögu-RNA þrátt fyrir að 1-2 núkleótíð
eða jafnvel fleiri væru mispöruð. Tíðni þess-
ara atburða var mismunandi á milli frumu-
lína og markgena19. Mótsvarandi röð leið-
sögu-RNA er einungis 20 núkleó tíð auk
þess sem PAM röðin verður að vera aðlæg
henni. Þrír millj arðar basa para eru í erfða-
mengi mannsins og því er hugsanlegt að
mótsvarandi röð leiðsögu-RNA parist við
erfðaefnið á öðrum stað en í markgeni sínu.
Ef aðferðin þolir mispörun 1-2 núkleótíða
af einungis 20 er ljóst að möguleikinn á að
leiðsögu-RNA bindist utan markgens eykst
mikið. Annar rannsóknarhópur ári síðar fékk
þær niðurstöður að stökkbreytingar utan
mark gens vegna CRISPR væru mjög sjald-
gæfar. Sá hópur rann sakaði fjöl gæfar stofn-
frumur (e. pluripotent stem cells) en fyrr nefnd
rann sóknin var á lang lífum frumu línum (til
dæmis HEK293T og K562) sem henta ekki
alltaf sem rannsóknar líkan fyrir sjúkdóma
í mönnum20. Í nýlegri rannsókn bjuggu
rannsak endur til afbrigði af Cas9 (SpCas9-
HF1) sem fækkaði stökkbreytingum utan
markgens þess til muna21.
Cas9 prótínið hefur tvær hvarfstöðvar, HNH
og RuvC, sem báðar eru innrænir kjarnsýru-
kljúfar (e. endonuclease). HNH og RuvC
klippa hvor sinn þátt DNA sam eindar innar.
HNH klippir mót svarandi þátt en RuvC
klippir sam svarandi þátt13. Le Cong og
sam starfs menn þróuðu stökkbreytta útgáfu
af Cas9 sem klýfur einungis annan þátt
DNA sameindarinnar í stað þess að mynda
tvíþátta brot. Þeir bjuggu til útgáfu af Cas9
(Cas9 D10A) með punktstökkbreytingu sem
breytti aspartik sýru í alanín í RuvC hvarf-
stöðinni þannig að hún óvirkjaðist. Þegar
einþátta brot á sér stað gerir fruman beint við
brotið og engin NHEJ-viðgerð á sér stað. Ef
tvö sgRNA eru leidd í frumuna sem þekkja
aðlæg set, verður tvíþátta brot og NHEJ
á sér stað. Kosturinn er að sértæknin eykst,
því ef sgRNA sameindirnar bindast utan
þeirra seta sem ætlunin er að breyta er gert
við erfðaefnið á mjög skilvirkan hátt án þess
að nokkrar breytingar verði. Mjög ólíklegt er
að tvær sgRNA sameindir bindist á sama stað
í erfða menginu utan þess sets sem ætlunin er
að erfðabreyta. Á þennan hátt er leitast við
að auka nákvæmni aðferðar innar og reynt
að hindra stökk breytingar utan markgensins
vegna CRISPR16.
Í stuttu máli er vísindaheimurinn ósam mála
um hvert sé umfang stökk breytinga utan
markgens en þróunarvinna er í gangi til að
gera aðferðina nákvæmari og öruggari.
Erfðabreytingar á fósturvísum
manna
Vísindaheimurinn hefur tekið CRISPR/
Cas tækninni opnum örmum, tæknin er
orðin útbreidd1 og meðal annars notuð hér
á Íslandi. Tæknin sjálf er tiltölu lega einföld
og ódýr í notkun fyrir rann sakanda með
þekkingu á sameinda líffræði og með henni er
til dæmis mögu legt að erfðabreyta fjölhæfum
stofn frumum úr fósturvísum manna. Úr
þeim stofn frumum má mynda sérhæfðar
frumur sem til dæmis má koma fyrir í dýrum
og mönnum. Framtíðarsýn marg ra vísinda-
manna er að nota þess ar að ferðir til að lækna
sjúkdóma22. Skömmu eftir að tæknin kom
á sjónar sviðið fóru hópar innan vísinda-
samfélagsins að ræða um að stökk breyta
ekki aðeins stofn frumum heldur fóstur-
vísum manna. Einungis tveimur árum eftir að
tækninni var lýst stökkbreyttu vísinda menn
í Kína fósturvísum apa og apar erfðabreyttir
með CRISPR urðu til23. Stuttu seinna sá
hópur vísindamanna í Bandaríkjunum, sem
leitt hefur rann sóknir á aðferða fræðinni, sig
knúinn til að vekja athygli á siðferðislegum
álitamálum CRISPR og hvetja til þess að
vísindamenn í samvinnu við stjórnvöld
smíðuðu regluverk til að koma í veg fyrir
misnotkun tækninnar22.
Lagaramminn á Íslandi er skýr. Í 14. grein
íslenskra laga um tæknifrjóvgun og not kun
kyn frumna og fósturvísa manna til stofn-
frumurannsókna kemur fram:
„Óheimilt er:
a. að rækta eða framleiða fósturvísa
eingöngu í þeim tilgangi að gera á
þeim rannsóknir,
   b. að rækta fósturvísa lengur en
í 14 daga utan líkamans eða eftir að
frumrákin kemur fram,
   c. að koma mannlegum fósturvísum
fyrir í dýrum,
   d. að framkvæma kjarnaflutning
í æxlunarskyni (einræktun) 2008.“24
Einnig þarf tilskilin leyfi heilbrigðis ráðherra
og nauðsynlegt er að upp fyllta strangar kröfur
til að fá að rann saka og þróa stofnfrumulínur
úr afgangs fósturvísum úr glasafrjóvgunum.
Heil brigðis stofnun sem hefur fengið slíkt
leyfi er „heimilt með upplýstu samþykki
kyn frumu gjafa að gera rannsóknir, tilraunir
og aðgerðir á fósturvísum sem verða til við
glasafrjóvgunarmeðferð og eru liður í henni
eða gerðar til að greina arfgenga sjúkdóma
í fósturvísunum sjálfum. Sama á við um
rannsóknir sem miða að fram förum í meðferð
vegna ófrjósemi eða eru ætlaðar til aukins
skilnings á orsökum meðfæddra sjúkdóma og
fósturláta“24.
Í febrúar síðastliðnum veittu Human Ferti­
li s ation & Embroylogy Authority (HFEA)
í Bretlandi vísinda mönnum leyfi til að nýta
CRISPR tæknina í rann sóknir á fóstur-
vísum. Fóstur vísar sem um ræðir eru afgangs-
fósturvísar frá tækni frjóvgunum sem yrði
annars eytt. HFEA komst að þeirri niður-
stöðu að CRISPR aðferðin væri hentug til
að rann saka og þróa meðferð við alvarlegum
sjúk dómum í frumulínum þróuðum úr fóstur-
vísum manna og einnig til að auka þekkingu
okkar á fósturþroskun og ófrjósemi. Í leyfinu
var tekið sérstaklega fram að óheimilt væri
að nota fóstur vísana til manneldis og ekki
leyfilegt að setja erfða breytta fósturvísa í leg
kvenna til með göngu. Jafnframt þarf að eyða
fósturvísum eftir 14 daga í rækt eða áður en
frumrákin (e. primitive streak) myndast2. Það
er því mikilvægt að átta sig á því að ekki var
gefið leyfi fyrir kynbótum á mönnum.
Reglur um fósturvísa eru ekki alls staðar
jafn strangar en CRISPR aðferðin hefur nú
þegar verið notuð í Kína til að erfða breyta
fósturvísum manna. Á síðasta ári notuðu
Puping Liang og samstarfs fólk aðferðina til
að erfðabreyta þrí kjarna manna fósturvísum25.
Þríkjarna fóstur vísar inni halda tvo kjarna frá
sitt hvorri sæðis frumunni og einn kjarna frá
egg frumu25. Egg voru frjóvguð og þríkjarna
ok frumur valdar en hinum eytt. Þríkjarna ok-
frumur geta myndað kím blöðru í tilrauna glasi
(e. in vitro) en geta aðeins ör sjaldan myndað
lifandi fóstur. Rannsóknar hópurinn innleiddi
CRISPR/Cas9 í okfrumurnar auk einþátta
DNA þáttar, sem gegndi hlutverki sniðmóts
fyrir HR-viðgerð. Markgen CRISRP/Cas9
var β-glóbín genið25.
Galli í β-glóbín geninu er algengasta ástæða
mar blæðis af gerð β (e. β­thalas semia)
í Kína. β-glóbín genið er hluti af glóbín
gena þyrpingu sem inni heldur mjög líkt gen,
δ-glóbín, ásamt öðrum glób ínum25. Það kom
í ljós að í rúmum helm ingi fóstur vísanna sem
höfðu tekið upp CRISPR/Cas9 hafði Cas9
klofið β-glóbín genið. β-glóbín genið hafði
verið lagfært með samstæðri endurröðun þar
sem einþátta DNA þátturinn var notaður sem
sniðmót í einungis 14,3% tilfella en δ-glóbín
genið var notað sem mót í 25% tilfella, sem var
ekki ætlunin. Í meirihluta fósturvísanna hafði
því ónákvæm NHEJ-viðgerð á skurðinum átt
sér stað og ekkert mót notað til að gera við