Læknablaðið - 15.12.2000, Page 15

FRÆÐIGR^INAR /ERFÐAGREINING
Meðalaldur þátttakenda var 29 ára (8-69 ára) og voru
sjö karlar og átta konur. Ellefu þátttakendur höfðu
ættarsögu um heyrnarleysi, en fjórir voru stök tilfelli.
Tafla I sýnir niðurstöður heyrnarmælinga á báðum
eyrum hjá þátttakendum. Rannsóknin var samþykkt
af Tölvunefnd Dómsmálaráðuneytis og Vísinda-
siðanefnd Sjúkrahúss Reykjavíkur.
Aðferðir: Erfðaefni þátttakenda var eingangrað
úr bláðæðablóði eins og áður hefur verið lýst (36).
Niturbasaraðir gena Cx26 og POU3F4 voru fengnar
af heimasíðu National Center for Biotechnology
Information í Bandaríkjunum (http://www.
ncbi.nlm.nih.gov) (32,37,38). Fákimi voru valin með
hjálp Genetool™ 1.0 forritsins (Biotools Incor-
porated, Edmonton, Kanada) og þau pöntuð frá
TAG Copenhagen A/S í Kaupmannahöfn. Gena-
bygging Cx26 og POU3F4, niturbasaröð fákima, sem
notuð voru við fjölliðunarhvörf (polymerase chain
reaction, PCR) og staðsetning þeirra í genunum eru
sýndar á myndum 1 og 2. Fjölliðunarhvörf á ein-
stökum DNA-bútum genanna voru gerð á hefð-
bundinn hátt nema hvað geislavirkt a- P dATP var
haft með í hvarfefnablöndu tO að merkja fjölfölduðu
bútana. Skimað var eftir erfðabreytileikum í DNA-
bútum með svokallaðri EMD-aðferð (enzymatic
mutation detection) og var hvarfefnasettið Pass-
port™ frá Amersham-Pharmacia Biotech, Kaup-
mannahöfn notað (39). Einfölduð mynd til skýringar
á aðferðafræði EMD er sýnd á mynd 3. Eftir að
misþátta (heteroduplex) DNA-bútar höfðu verið
meltir með T4 endónúkleasa VII, voru þeir raf-
dregnir í 6% raðgreiningargeli. Að loknum rafdrætti
var röntgenfilma lögð að gelinu og hún framkölluð
um sólarhring seinna. Niturbasaröð þeirra DNA-
búta, sem sýndu merki um að hafa verið klofnir af T4
endónúkleasa VII vegna mispörunar, var ákvörðuð
með því að nota sömu fákirni og við fjölföldunina,
a- P dATP, a- P dCTP, hvarfefnasettið Thermo-
Sequenase™ frá Amersham Pharmacia Biotech,
Kaupmannahöfn og 6% DNA raðgreiningargel.
Niðurstöður
Cx26 gen: Við leit að erfðabreytileikum með EMD
aðferð komu fram merki um erfðabreytileika í
fjölfölduðum DNA bútum Cx26 gens hjá fjórum
einstaklingum. Dæmi um greinilega jákvæða EMD
skimun fyrir erfðabreytileika má sjá í mynd 4. í bút
Ex2a í Cx26 geni komu fram merki um þrjá
mismunandi breytileika. Sams komar EMD mynstur
í rafdráttargeli fundust hjá þátttakendum númer átta
og níu (tafla I), annað mynstur fannst hjá
þátttakenda númer tvö og það þriðja hjá einstaklingi
sem notaður var sem viðmiðunarsýni. í bút Ex2b
fannst merki um erfðabreytileika hjá þátttakenda
númer níu.
Raðgreining á DNA bút Ex2a hjá einstaklingi
númer tvö sýndi arfblendni fyrir erfðabreytileika, þar
POU3F4 gene
Exon 1
PCR-fragments
PCR- Forward primer Reverse primer
fragments
Exla ACATTATAACTAGTAGGGGATCCTCACCG GGGTTGGCCGCTTGACGTG
Exlb ACTCACCGCACACTAACCACCCC ACCATACAGTGTGCCCAGCGCC
Exlc AAGAATCAAGTTGGGCTTCACGCAGG GAGAGAAAGGAAATCCCGCGCTGCT
Figure 1. Schematic representation ofthe POU3F4 gene. Lines under the schematic gene
represent the overlapping PCR fragments amplifed for mutation analysis. The nucleotide
sequence ofthe primers usedfor amplification is also given.
Connexin 26 gene
Exon 1 Exon 2
PCR-fragments
PCR- Forward primer
fragments
Exl GGGGTGTGGGGTGCGGTTAAAA
Ex2a TGCTTGCTTACCCAGACTCAGAGAA
Ex2b TGGCCTACCGGAGACATGAGAAG
Reverse primer
GCTCTGGGTCTCGCGGTCCCT
TCTCCCCCTTGATGAACTTCCTCTT
GCCTCATCCCTCTCATGCTGTCT
Figure 2. Schematic representation of the two exons of the connexin 26 gene. Lines under
the schematic gene represent the PCR fragments amplifed for mutation analysis. The
nucleotide sequence ofthe primers usedfor amplification is also given.
Figure 3. Scliematic drawing oftlie principles of enzymatic mutation detection (EMD).
Læknablaðið 2000/86 835