Læknaneminn - 01.10.1994, Page 7

kalla má markþráð (target strand), telur gjarnan frá 50
til 1500 basapör. Ekki er nauðsynlegt að þekkja til
fulls niðurröðun basa á markþræðinum. 1 fyrstu
tvöfaldast lengri þráður en sá sem liggur milli
upphafskirnanna en eftir annan hring tekur
markþráðunum að fjölga mest og þeir verða fljótlega
yfirgnæfandi. Fræðilega séð getur magn kirnisins
sem liggur milli upphafskirnanna tvöfaldast í hvert
sinn sem sveiflan eða hringurinn er endurtekinn.
Þannig má milljónfalda magn markþráðarins í
tilraunaglasi á nokkrum klukkustundum. Til verður
safn kirna sem öll eru eins og gera má athuganir á, sem
ókleift væri að gera á einstökum sameindum vegna
smæðar þeirra.
Rannsóknin sem lýst er hér að ofan virðist einföld.
Hún er þó mun erfiðari í framkvæmd en lýsingin
gefur til kynna og þær rannsóknaraðferðir sem nú eru
að sanna hagnýti sitt eru um margt ólíkar upphaflegu
tilraununum. Það var til dæmis mikil framför þegar
svokallaður Taq-pólýmerasi fannst. Hann er unninn
úr hitakærri bakteríu sem nefnist Thermus aquaticus.
Hann er hitaþolinn og þolir það hitastg sem notað er
viðkeðjufjölföldunina. Aðurvarnotastviðpólýmerasa
sem brotnaði niður við bræðslumark kjarnasýranna
og því þurfti að bæta hvata út í lausnina í hverjum
hring, 30 til 50 sinnum fyrir hvert ferli. Einnig hefur
þekking manna á því við hvaða aðstæður efnahvörfin
eru skilvirkust aukist mjög.
Upplýsingar um samsetningu litninga rnanna og
dýra eykst hratt. Auðvelt er að afla smákima ef
þekking er fyrir hendi á tveimur stuttum svæðum á
litningnum, sem ekki liggja of langt frá hvoru öðru.
Margar rannsóknarstofur ráða nú yfir tækjum
(sequencer) sem framleiða sjálfvirkt hvaða smákirni
sem vera skal eftir forskrift.
Fræðilega séð má finna eina tiltekna erfða-
efnissameind með aðferðinni, eins og nál í heystakki
og margfalda milljónfalt. Þó næmið sé í raun minna er
aðferðin því, eðli málsins samkvæmt, afar viðkvæm
fyrir krossmengun. Því er nauðsynlegt að aðskilja
einstaka hluta ferlisins og gæta þess að kirni, sem
fjölfölduð hafa verið, komi ekki í þann hluta
húsnæðisins sem notaður er við undirbúning sýna
undir fjölföldun. Ferlið þarf að flæða í eina átt eftir því
húsnæði sem notað er og aðferðin krefst því tiltölulega
mikils og góðs húsnæðis.
PCR og klínísk sýklafræði.
í lok síðustu aldar, þegar örverufræðin og sýkla-
fræðin urðu til, var lagður grunnur að mestu framförum
læknavísindanna til þessa og hinum gífurlegu áhrifum,
sem læknisfræði hefur haft á mannlegt samfélag á
þessari öld. Fyrst eftir að samhengið ntilli sýkla og
smitsj úkdóma kom í ljós, uppgötvuðust orsakir margra
alvarlegra og mannskæðra sjúkdóma á tiltölulega
stuttum tíma. Með fulltingi annarra vísindagreina,
svo sem efna- lífefna- og ónæmisfræði, urðu miklar
framfarir í greiningu, forvörnum og meðferð
smitsjúkdóma. Þettatímabil byllingakenndraframfara
í sýklafræði náði hámarki með tilkomu sýklalyfja um
miðja öldina. Eftir tilkomu þeirra dró nokkuð úr
fjölgun nýrra uppgötvana í sýklafræði, einkum
bakteríufræði. Réði þar mestu um óhófleg bjartsýni
á mátt sýklalyfjanna og það að frekari framfarir biðu
nýrra uppgötvana í öðrum vísindagreinum. Þegar leið
á öldina uppgötvuðust þó nokkur, áður óþekkt,
orsakatengsl milli sjúkdóma og baktería. Sem dæmi
frá síðustu áratugum má nefna orsakir niðurgangs svo
sem Yersinia enterocolitica, Clostridium difficile og
Campylobacterjejuni, orsakir kynsjúkdóma svo sem
Chlamydia trachomatis, orsök Hermannaveiki og
orsakatengslin milli Helicobacter pylori og maga- og
skeifugarnarsára.
Þrátt fyrir rniklar framfarir í sýklafræði á öldinni er
grunnaðferðin sem notuð er til bakteríugreininga enn
sú sama og notuð var fyrir síðustu aldamót. Hún
byggist á því að einangra bakteríufrumu og færa
henni ríkulegt æti og nýta sér þann eiginleika hennar
að hún fjölgar sér með skiptingu. Við hverja skiptingu
verða til tvær frumur sem fræðilega eru alveg eins.
Þar sem kynslóðatími (generation time) algengra
baktería er oft um 20 mínútur má ntilljónfalda
bakteríufrumurnar á nokkrum klukkustundum með
því að sjá til þess að æti sé nægilegt. Síðan má gera
margskonar athuganir á bakteríusafninu sem ókleift
væri að gera á einstökum frumum vegna smæðar
þeirra.
Óneitanlega minnir þessi lýsing á pólýmerasa
fjölföldunina sem áður var lýst. I stað frumna er nú
mögulegt að finna og fjölfalda tiltölulega litla búta af
litningi bakteríanna. Það sem til þarf er vitneskja um
basasamsetningu tveggja búta af DNA-þræðinunt
sem liggja nær hvor öðrum en sem svarar 1500 til
2000 basapörum en skarast ekki. Ef sú vitneskja er
LÆKNANEMINN 2 1994 47. árg.
5