Læknablaðið : fylgirit - 01.12.2000, Page 75

ÁGRIP VEGGSPJALDA / X. VÍSINDARÁÐSTEFNA LÆKNADEILDAR HÍ I
V 53 Tengsl stökkla og stökkbreytimynsturs í erfðamengi
■"annsins
Hans Tómas Björnsson', Jón Jóhannes Jónsson’-2
Lífefna- og sameindalíffræðistofa læknadeildar HÍ, 'meinefnafræöideild Landspít-
ala Hringbraut
Netfang: htb@hi.is
Inngangur: Rúmlega þriðjungur erfðamengis mannsins sam-
anstendur af endurteknum röðum og er meirihluti þeirra talinn
yera stökkulerfðaefni. Hugsanlegt bælikerfi gegn stökklum gæti út-
skýrt hvers vegna stökklar valda sjaldan stökkbreytingum í mönn-
um. Tilgáta hefur komið fram um að slíkt bælikerfi sé til staðar og
Wggi á metýleringu á CpG tvíbasanum. Ef þessi kenning er rétt
g®tu sést tengsl milli magns aðlægra stökkla og fjölda metýltengdra
CpG stökkbreytinga í táknröð.
Efniviður og aðferðir: Gen með fleiri en 10 stökkbreytingar í stökk-
breytibankanum Human Gene Mutation Database (HGMD) og
samfellu (contig) hjá National Center for Biotechnology In-
formation (NCBI) voru valin í rannsóknarhóp. Að auki þurftu gen
að hafa að minnsta kosti 1 Kb röð þekkta hvorum megin við tákn-
röð. Þessi skilyrði uppfylltu 57 gen. Magn stökkulerfðaefnis var
rrietið í netvinnslugagnabankanum CENSOR. Metýltengdar CpG
stökkbreytingar voru taldar í gögnum frá HGMD. Loks voru tengsl
®illi niagns stökkulerfðaefnis og hlutfallslegs fjölda metýltengdra
EpG stökkbreytinga metin.
^iðurstöður: Marktækt samband fannst ekki milli heildarmagns
stökkulerfðaefnis og fjölda metýltengdra CpG stökkbreytinga í
táknröð. Tæplega fimmtungur rannsóknarhóps hafði stökkulerfð-
efni f mRNA röð. Sá undirhópur hafði fremur lágt meðalhlutfall
metýltengdra CpG stökkbreytinga (11%) miðað við heildarhóp
(20%).
'Tlyktanir: Ef kenning um hýsilvarnir erfðamengis væri rétt og
metýlering í erfðamenginu réðist að mestu af heildarmagni stökkla
m®tti búast við aukinni tíðni metýltengdra CpG stökkbreytinga í
nknröðum gena með mikið af aðlægum stökklum. í niðurstöðum
°kkar virtust stökklar lítil áhrif hafa á fjölda metýltengdra CpG
stökkbreytinga í táknröð. Stökklar virðast því ekki vera eins ríkj-
<lndi þáttur í staðsetningu metýleringar og ofangreind tilgáta gerir
ráð fyrir
4 Magnmælingar á erfðaefni og mRNA mæði-visnuveiru
e° RT-PCR samhliða flúrljómunarmælingum á rauntíma
.!apki Guðmundsson', Helga Bjarnadóttir'2, Steinunn Kristjánsdóttir1-2,
°n d- Jónsson'-2
ir5?fna' °8 sameindalíffræðistofa læknadeildar HÍ, ;meinefnafræðideild Landspít-
^Hringbraut
ang: bjarkigu@hi.is
"rigangur: Tímgunarhringur lentiveira felst í skrefum þar sem
n°kkrir cis og trans erfðaþættir eru nauðsynlegir. Rannsóknir á
v*rkni þeirra in vitro í frumurækt eða in vivo í dýri væru rniklu skil-
lrkari með tilkomu öflugra, næmra og nákvæmra magnmælinga
?r^aefnis og mRNAs veiranna. Við höfum þróað slíkar aðferðir
lr Lrfðamengi mæði-visnuveiru (MVV). Þær byggja á PCR sam-
a Húrljómunarvokorkuflutningi (fluorescence resonance
n.er8y fransfer (FRET)) á rauntíma. Sértækni mæliaðferða fyrir
munandi mRNA sameindum mæði-visnuveiru fæst með notkun
'nna vísibindiseta ásamt FRET á milli tveggja flúrljómandi
þreifara sem eru sitt hvorum megin við splæsset.
Efniviður og aðfcrðir: Liðþelsfrumur úr kindafóstri (FOS) voru
sýktar með mæði-visnuveiru klóni KV1772 og RNA var einangrað
úr umfrymi og frumuræktarvökva. RT-PCR var framkvæmt og
PCR afurðir mRNAs veirunnar voru klónaðar. Raðgreining var
gerð til að ákvarða að um rétt umrit var að ræða og til að kortleggja
splæsset nákvæmlega fyrir smíði FRET þreifara. Þessi klón voru
einnig notuð sem staðlar fyrir magnmælingar á mRNA veirunnar í
frumurækt. Til að magnmæla genómískt RNA mæði-visnuveiru var
klón KV1772 notað sem staðall.
Niðursföður og ályktanir: Þróaðar voru sérhæfðar mæliaðferðir til
að mæla gag-pol, tat, rev, env og w/umrit, Mælingarnar voru línuleg-
ar á milli 60 til 6 x 107 eintaka af sameindum. Með mæliaðferðunum
var hægt að greina og mæla samsvarandi mRNA í mæði-visnuveiru
sýktum FOS frumum en svar kom ekki fram í ósýktum frumum.
Einnig var hægt að magnmæla genómískt RNA í floti sýktra frumu-
rækta með því að gera RT-PCR með vísum fyrir gag genið og nota
þær niðurstöður til að meta títer á íljótan hátt.
Magnmælingarnar er hægt að nota til rannsókna á hlutverki erfða-
þátta við mæði-visnuveiru sýkingu. Einnig er hægt að nota þær til að
prófa genaferjur og pökkunarkerfi byggð á mæði-visnuveiru.
V 55 Þróun aðferða til að mynda á sértækan hátt langar og
stuttar DNA sameindir sem innihalda skilgreindar skemmdir af
völdum útfjólublárrar geislunar
Guðmundur Heiðar Gunnarsson . Jón Jóhannes Jónsson' 2
'Lífefna- og sameindalíffræðistofa læknadeildar HÍ, Jmeinefnafræðideild Landspít-
ala Hringbraut
Netfang: ghg@hi.is
Inngangur: Þekktasta orsök húðkrabbameina er útfjólublá (UV)
geislun. Verði DNA fyrir útfjólublárri geislun myndast blanda ó-
líkra DNA skemmda. Þar af eru þrjár gerðir skemmda algengastar,
CPD , 6-4 og Dewar skemmd. Ein af forsendum rannsókna á því
hvernig lífverur bregðast við skemmdum af völdum útfjólublárrar
geislunar er að hafa til staðar nokkuð langar DNA sameindir sem
innihalda skilgreinda skemmd. Slíkar DNA sameindir má meðal
annars nota til að skoða bindingu prótína við skemmdina og sem
hvarfefni til mats á viðgerðum skemmda in vitro. Auk þess væru
slíkar sameindir hentugar til ítarlegri þróunar á aðferðum til að
meta myndun skemmda.
Efniviður og aðferðir: Til eru aðferðir til að mynda ljósskemmdir í
DNA sameindum. Slíkar aðferðir eru oft flóknar og notast er við
sérhæfð tæki sem ekki eru algeng á rannsókastofum. Þróaðar voru
einfaldar aðferðir til að mynda þrjár algengustu skemmdirnar.
CPD skemmdin var mynduð með því að geisla sérhannað einþátta
DNA(30 pmól/pl í 20 mM acetophenonlausn) á 300 nm ljósaborði.
6-4 skemmdin var mynduð með geislun á einþátta DNA (30
pmól/pl í ddHzO). Með því að geisla hluta 6-4 skemmdar frekar við
365 nm var henni breytt yfir í Dewar skemmd. Myndun CPD
skemmdar var metin sértæku niðurbroti með T4endV. Myndun 6-4
skemmdar var metin með heitu basísku niðurbroti og myndun
Dewar skemmdar með köldu basísku niðurbroti. Eftir geislun voru
bútarnir gerðir tvíþátta. Til að eyða þeim bútum sem ekki innihéldu
neina skemmd voru CPD bútar skornir með Sspl en 6-4 og Dewar
bútar með EcoRV. Eftir skurð voru bútar sem innihéldu ljós-
skemmd einangraðir úr geli. Myndaðir voru langir DNA bútar (300
Læknablaðið / FYLGIRIT 40 2000/86 75