Læknablaðið : fylgirit - 01.01.2007, Page 40

ÁGRIP ERINDA / XIII. VÍSINDARÁÐSTEFNA HÍ
E 45 Bein einangrun á lengdarbreytileika í umritunar-
mengjum
Bjarki Guðmundsson', Sólveig Kristfn Guðnadóttir2, Guðmundur Heiðar
Gunnarsson12, Hans Guttormur ÞormarU3, Jón Jóhannes Jónsson2'3
■Lífeind ehf., 2lífefna- og sameindalíffræðistofa, læknadeild HÍ, 3erfða- og
sameindalæknisfræðideild Landspítala
bjarki@biocule. com
Inngangur: Talið er að afurðir um 50% gena gangist undir
valsplæsingu, sem mikilvægt er að rannsaka með tilliti til
stjórnunar og þess hvaða afleiðingar hún hefur á virkni próteina.
Mikill skortur er á skilvirkum aðferðum til að rannsaka og
einangra valsplæsingar. Rannsakendur hafa þróað tvívíðan
þáttaháðan rafdrátt (2D-SDE) sem er notaður til að aðgreina
kjarnsýrur eftir þætti og lengd, auk þess sem hægt er að aðgreina
réttparaðar og misparaðar DNA sameindir. Markmið þessa
verkefnis var að beita 2D-SDE aðferðinni til að einangra úr
cDNA sýni lengdarbreytileika af völdum valsplæsinga.
Efniviður og aðferðir: cDNA var víxlritað eftir mRNA úr 293T
frumulínu. cDNA var skorið, aðhæfar límdir á enda og þeir
notaðir sem vísar í PCR mögnun. Aðhæfar voru fjarlægðir, sýnið
brætt og eftir stutta endurblendingu var sýnið styrkjafnað með því
að fjarlægja tvíþátta DNA. Þetta var gert með mangan fellingu á
einþátta DNA, sem er aðferð þróuð af rannsóknarhópnum.
Einþátta DNA sameindum sem eftir voru í sýninu var í kjölfarið
endurblendað til að mynda misparanir. Mispöruðu sameindirnar
voru einangraðar með 2D-SDE, þær magnaðar upp og klónaðar.
Niðurstöður og ályktanir: Aðstæður PCR mögnunar cDNA
sýnis voru staðlaðar fyrir hæst hlutfall tvíþátta DNA sameinda
miðað við einþátta. í framhaldinu voru skilgreindar skilvirkustu
endurblendingaraðstæður og þær kannaðar með rafdrætti á
2D-SDE. Til að jafna út styrk afurða var sýnið endurblendað í
30 sekúndur sem nægði til að gera búta í háum styrk tvíþátta.
Eftir slíka endurblendingu var hægt að einangra allar einþátta
cDNA sameindir með mangan fellingu, endurblenda þeim á
ný og þar með styrkjafna sýnið á einfaldari hátt en áður hefur
þekkst. Unnið er raðgreiningu klóna og samanburði við þekktar
valsplæsingar í gagnabönkum.
E 46 Tjáning Aquaporin 9 gensins í miðtaugakerfi músar
Pétur H. Petersen
Læknadeild HÍ
phenry@hi.is
Inngangur: Aquaporin 9 er himnubundið prótein er hleypir vatni,
glýceróli og öðrum smásameindum í gegnum frumuhimnuna.
Starfsemi Aqp9 próteinsins er best þekkt í lifur þar sem að Aqp9
sér líklega um flutning á glýceróli en ntögulega líka eiturefna eins
og arsenite. Aqp9 genið fannst 1998 og síðan þá hefur tjáningu
þess verið lýst meðal annars í miðtaugakerfi nagdýra. Þannig
hefur Aqp9 próteinið verið staðsett í stjörnufrumum heilans
og í undirflokkum taugafrumna til dæmis taugafrumum í sorta
(substanstia nigra). Þar sem þær frumur deyja í Parkinsons
sjúklingum hefur kviknað sú hugmynd að Aqp9 gæti gert þær
viðkvæmari fyrir og til dæmis orðið til þess að þær taka upp
smásameindir sem gætu leitt þær til dauða eftir óþekktum
leiðum.
Efniviður og aðferðir: Nýlega hefur verið útbúin mús án hluta
Aqp9 gensins og er hún hentugt tæki til að rannsaka hlutverk
þess, en einnig til að sannreyna lýsingar á tjáningu gensins
og staðsetningu próteinsins. Borin var saman tjáning Aqp9
gensins (RNA in situ, rtPCR, real time PCR) og Aqp9 próteins
(mótefnalitun vefja og gullmótefnalitun) í mús með og án hluta
Aqp9 gensins.
Niðurstöður og ályktanir: Tjáningu Aqp9 í lifur var staðfest en
niðurstöður styðja síður fyrri ályktanir um tjáningu, og þar af
leiðandi hlutverk, Aqp9 í miðtaugakerfi. Niðurstöður undirstrika
mikilvægi erfðabreyttra líffvera í greiningu á genastarfsemi og til
að staðfesta sértækni mótefna.
E 47 Hlutverk boðleiða í starfsemi Mitf umritunarþáttarins
Jón Hallsleinn Hallsson1'2' Norene O’Sullivan3' Heinz Arnheitei4' Neal G.
Copeland3- Nancy A. Jenkins3' Eiríkur Steingrímsson1
■Lífefna- og sameindalíffræðistofa, læknadeild HÍ, 2Rannsóknarstofa í
sameindaerfðafræði, auðlindadeild Landbúnaðarháskóla fslands, 3National
Cancer Institute, Frederick, USA, 4National Institutes of Health, Bethesda,
USA
jonhal@lbhi.is
Inngangur: Umritunarþátturinn MITF (microphthalmia-asso-
ciated transcription factor) tilheyrir MYC fjölskyldu basic
Helix-Loop-Helix Leucine zipper (bHLH-Zip) umritunarþátta.
Stökkbreytingar í Mf/geninu í mús hafa áhrif á þroskun nokk-
urra frumutegunda, þar með taldar litfrumur í húð og auga,
mastfrumur og beinátsfrumur. Nýlega hefur verið sýnt að Mitf
gegnir einnig mikilvægu hlutverki við að tryggja lifun stofn-
frumna litfrumna (melanocyte stem cells) auk þess sem yfirtján-
ing þess getur valdið myndun sortuæxla. Mitf próteinið er fos-
fórað á nokkrum amínósýrum, þar með talið á Ser73 og Ser409
amínósýrunum. Kit boðleiðin og Map kínasarnir Erk2 og p90Rsk
hvata fosfórun þessara amínósýra en það hefur þær afleiðingar
að umritunarvirkni próteinsins eykst og stöðugleiki minnkar.
Boðleið þessi er mikilvægt líkan fyrir starfsemi boðleiða almennt
en þar sem einungis hefur verið sýnt fram á mikilvægi hennar in
vitro er mikilvægt að greina einnig hlutverk hennar in vivo.
Efniviður og aðferðir: Til að rannsaka hlutverk þessara boðleiða
í starfsemi Mitf próteinsins voru framkvæmdar tvenns konar
erfðabreytingar. Annars vegar voru búnar til knock-in mýs þar
sem Serín amínósýru 73 var breytt í Alanín og svipgerð músanna
athuguð. Hins vegar voru búnar til BAC transgenískar mýs sem
báru um 200kb BAC klón sem geyma Mt/genið og stökkbreytt
hafði verið þannig að Ser73 og Ser409 var breytt í Alanín. Athuguð
var hvort mýs sem voru transgenískar fyrir stökkbreyttar BAC
genaferjur gátu leiðrétt svipgerð M'í/stökkbrcytinga.
Helstu niðurstöður og ályktanir: Niðurstöður okkar sýna að
stökkbreytingar í Ser73 og Ser409 setunum hafa ekki augljós
áhrif á svipgerð erfðabreyttra músa og benda niðurstöðurnar til
þess að í raun hafi fosfórun á Ser73 og Ser409 amínósýrunum
lítið að segja fyrir virkni Mitf in vivo. Hugsanleg skýring er
40 læ
knablaðið/fylgirit 53 2007/93