Læknablaðið : fylgirit - 01.12.2004, Page 74

AGRIP VEGGSPJALDA / XII. VISINDARAÐSTEFNA Hl
V 08 Smíði sprouty genaferja til að kanna hlutverk sprouty
stjórnpróteina í týrósín kínasa örvuðum æxlisfrumum
Silja Dögg Andradóttir'. Magnús Karl Magnússon2
‘Læknadeild HI, 2rannsóknastofa í blóðmeinafræði og erfða- og sameinda-
læknisfræði Landspítala
magnuskm@Icmdspitali.is
Inngungur: Týrósín kínasar eru lykilvaxtarstjórnarprótein og
hafa örvandi stökkbreytingar í þessari genafjölskyldu verið
tengdar fjölmörgum æxlistegundum. Við höfum klónað og lýst
eiginleikum nýs krabbameinsgens af þessum flokki, RabaptinS-
PDGFfiR, sem er samrunagen þar sem PDGF6R týrósín kínasa-
hneppi hins nýja samrunapróteins er viðvarandi örvað. Genið
var einangrað úr sjúklingi með langvinnt mergfrumuhvítblæði en
skyldum samrunagenum af flokki týrósín kínasa hefur verið lýst í
mörgum undirflokkum mergfrumuhvítblæða. Nýlega hefur verið
lýst nýrri genafjölskyldu sem kallast sprouty og hafa þau hlutverki
að gegna í því að bæla boð frá týrósín kínösum. Fjögur afbrigði
eru þekkt í mönnum (sprouty 1-4) en ekkert er vitað um hlut-
verk þessara gena við að bæla boð frá örvuðum týrósín kínösum
í æxlisfrumum. Við höfum lokið smíði genaferja til að rannsaka
hugsanlegt stjórnunarhlutverk sprouty í vaxtarstjórnun PDGF6R
örvaðra æxlisfrumna og þannig fá beinar upplýsingar um hvort
þessi genafjölskylda hafi hlutverki að gegna í þeim flokki æxla
sem einkennast af stökkbreyttum týrósín kínösum.
Aðferðir og niðurstöður: Sprouty 1-3 genin eru öll í einni útröð
og var því hægt að magna genin beint upp úr genómísku manna-
DNA. Öll genin voru mögnuð upp framan við stopp-kóða gen-
anna til að hægt væri að klóna þær inn í tjáningargenaferju sem
inniheldur 3'endamerkt Myc og His epítóp. PCR afurðirnar voru
í fyrsta skrefi klónaðar TA-klónunar-genaferju. Sprouty genin
þrjú í genaferjunum voru öll raðgreind til að tryggja að engar
stökkbreytingar hefðu átt sér stað. Lokaskrefið í smíði ferja var
síðan flutningur genanna úr TA-klónunar ferjunum yfir í tjáning-
arferju, pcDNA3.1-3'His-myc-tag. Þessar sprouty-genatjáning-
arferjur eru nú tilbúnar til notkunar í frumulínum. Nú standa yfir
sýkingar með genatjáningarferjunum í frumulínuna Ba/F3, sem
innihalda Rabaptin-5-PDGFfiR samrunagenið til að kanna áhrif
sprouty fjölskyldunnar á týrósín kínasa æxlisgen.
Alyktanir: Smíðaðar hafa verið genaferjur sem innihalda sprouty
1-3 og því verið sköpuð forsenda til að kanna hlutverk þessarar
genafjölskyldu í stjórnun á æxlisgenum af fjölskyldu týrósín kín-
asa.
V 09 Varðveisla Mitf umritunarþáttarins veitir upplýsingar
um starfsemi
Jón Hullstcinn Hallsson, Alexander Schepsky, Eiríkur Steingrímsson
Lífefna- og sameindalíffræðistofa læknadeildar HI
jonhal@hi.is
Inngangur: Mitf umritunarþátturinn er meðlimur í MYC fjöl-
skyldu basic-Helix-Loop-Flelix Leucine zipper umritunarþátta.
Yfir 25 stökkbreytingar hafa fundist í Mitf geni músarinnar auk
fjölmargra stökkbreytinga í Mitfgeni annarra lífvera. í mönnum
eru þekktar að minnsta kosti átta stökkbreytingar og valda þær
Tietz og Waardenburg IIA heilkennum í mönnum. Mitf er einnig
tjáð í nær öllum melanóma æxlum sem skoðuð hafa verið. Mitf
er því mikilvægt líkan fyrir rannsóknir á mannasjúkdómum auk
þess að vera áhugavert líkan fyrir grunnrannsóknir á starfsemi
umritunarþátta.
Efniviður og aðferðir: í þessu verkefni berum við saman yfir 40
Mitf gena og afurðir þeirra í mismunandi lífverum, frá þráðorm-
um til spendýra. Notast er við aðferðir lífupplýsingafræðinnar
til að bera raðirnar saman, meta skyldleika og greina varðveitt
hneppi í próteininu. Þessar upplýsingar mætti einnig nýta til þess
að bera kennsl á aðrar mikilvægar raðir, svo sem áður óþekktar
útraðir og stjórnraðir í stýrisvæðum gensins.
Niðurstöður og ályktanir: Mitf genið er mjög vel varðveitt meðal
spendýra. Sem dæmi má nefna að amínósýruröð próteinsins er
því sem næst fullkomlega varðveitt. Meðal fjarskyldari lífvera
minnkar varðveislan og ákveðin hneppi standa upp úr sem mjög
vel varðveitt, þar með talið DNA bindihneppi próteinsins og
tvenndarmyndunarhneppi. Auk þessara þekktu varðveittu svæða
eru þrjár áður óþekktar raðir innan Mitf próteinsins sem eru
mjög vel varðveittar milli fjarskyldra dýrategunda. Þessar raðir
hafa enn ekki verið tengdar við ákveðið hlutverk í próteininu en
gætu hugsanlega skýrt margt í hegðun Mitf próteinsins.
V 10 Hlutverk SUMO próteins í starfsemi Mitf umritunar-
þáttarins
Bryndís Krogli Gísladóttir1. Alexander Schepsky1, Jón Hallsteinn Hallsson1,
Gunnar J. Gunnarsson1, Eiríkur Steingrímsson1
'Lífefna- og sameindalíffræðistofa læknadeildar HI
bryndgi@hi.is
Inngangur: Mitf próteinið er meðlimur MYC stórfjölskyld-
unnar og tilheyrir umritunarþáttum af bHLHZip fjölskyldu.
Rannsóknir á stjórnun á virkni Mitf umritunarþáttarins hafa leitt
í ljós að fosfórýlering gegnir mikilvægu hlutverki í að auka umrit-
unarvirkni og minnka stöðugleika próteinsins. Amínósýrurnar
S73, S298, S307 og S409 eru fosfórýleraðar á sérvirkan hátt.
Einnig er vitað að Mitf er ubiquitylerað á K201 og niðurbroti
þess þannig stjórnað. Ýmislegt bendir til þess að SUMO-hópur-
inn skipti máli fyrir starfsemi Mitf próteinsins en algengt er að
viðbót hans bæli umritunarvirkni umritunarþátta. Markprótein
sumoyleringar verða að innihalda svokallað SUMO-set, i|iKXE,
þar sem K gegnir aðalhlutverki í tengingu við SUMO. Tvö slík set
eru varðveitt í M/7/geninu.
Efniviður og aðferðir: Til að greina hlutverk SUMO í starfsemi
Mitf próteinsins í músum hafa bæði SUMO-setin verið stökk-
breytt í Mitf geninu. Stökkbreyting var útbúin í BAC klóni sem
ber allt M/7/genið fyrir utan exonl með notkun endurröðunarað-
ferðar. Notast var við svokallaða „Hit and Fix“ aðferð.
Niðurstöður: Búin hafa verið til tvö BAC klón með sitt hvora
stökkbreytinguna í SUMO setunum, það er K182R og K316R.
Unnið er að því að koma þeim klónum fyrir í mús sem ber Mitf
stökkbreytingu en þannig má ákveða hvort og þá hvenær SUMO
skiptir máli í starfsemi Mitf próteinsins. Auk þess er verið að búa
til klón sem mun bera báðar stökkbreytingarnar.
74 Læknablaðið/fylgirit 50 2004/90