Læknablaðið : fylgirit - 01.12.2004, Page 36

AGRIP ERINDA / XII. VISINDARAÐSTEFNA Hl
E 34 Tvívíður þáttháður rafdráttur til rannsókna á flóknum
erfðaefnissýnum
GuAmundur Heiftar Gunnarsson1-2, Bjarki Guðmundsson2, Hans Guttormur
Þormar', Jón Jóhannes Jónsson'3
'Lífefna- og sameindalíffræðistofa læknadeildar HÍ, 2Lífeind, 3erfða- og
sameindalæknisfræðideild Landspítala
ghg@hi.is
Inngangur: Einþátta kjarnsýrusameindir hafa minni færsluhraða í
PAGE rafdrætti en jafnlangar tvíþátta sameindir. Því er á einfald-
an hátt hægt að aðskilja og magngreina slíkar blöndur af einþátta
og tvíþátta kjarnsýrusameindum ef þær eru af einni lengd. Skortur
er á öflugum aðferðum til aðskilja, magn- og lengdargreina ein-
og tvíþátta kjarnsýrusameindir í flóknum erfðaefnissýnum. Slíkar
aðferðir mætti meðal annars nota til að: i) áætla magn og lengd-
ardreifingu bæði ein- og tvíþátta kjarnsýrusameinda, ii) meta
skilvirkni endurblendingahvarfa, iii) til að hámarka gæði flókinna
mögnunarhvarfa, iv) meta cDNA myndun og v) greina rofset.
Við lýsum þróun tvívíðs rafdráttarkerfis fyrir þáttaháðan aðskiln-
að á flóknum kjarnsýrusýnunr.
Efniviður og aðferðir: Mynduð voru misflókin tvíþátta prófefni
með skurði á lambda- og mannerfðaefni. Hluti prófefnanna var
gerður einþátta með bræðslu. Flókið cDNA safn var myndað úr
RNA einangruðu úr mannafrumum. Prófefnin voru notuð til að
staðla rafdráttarkerfið. Magnaðar voru upp flóknar samsvaranir
úr erfðamengi mannsins og rafdráttarkerfið notað til að meta
samsetningu afurðanna og í framhaldi til að hámarka slík mögn-
unarhvörf.
Niðurstöður: Hægt var að aðskilja flókin sýni af ein- og tvíþátta
kjarnsýrusameindum á magnbundinn hátt auk þess sem hægt var
að meta lengdardreifingu innan hvors hóps fyrir sig. Hægt var að
meta á magnbundinn hátt skilvirkni endurblendingar á flóknu
DNA sýni. Aðferðin var einnig notuð til að hámarka gæði flók-
inna samsvarana og til að greina rofset í flóknum sýnum.
Ályktanir: Við höfum þróað tvívíðan þáttaháðan rafdrátt til að
greina ein- og tvíþátta kjarnsýrur á magnbundinn hátt. Pessi
aðferð opnar nýja möguleika á greiningu flókinna sýna og er sér-
staklega öflug til að hámarka gæði flókinna mögnunarhvarfa.
E 35 Staðsetning pökkunarraða mæði-visnu veirunnar
(MW)
Helga Bjarnadóttir12, Bjarki Guðmundsson', Janus Freyr Guðnason', Jón
Jóhannes Jónsson1-2
'Lífefna- og sameindalíffræðistofa læknadeilar HI, 2erfða- og sameindalækn-
isfræðideild Landspítala
hhjarna@rhi.hi.is
Inngangur: Pökkun tvíþátta RNA erfðaefnis í veiruagnir í tímg-
unarhring víxlveira felur í sér sérhæft samspil RNA stilklykkja
við kjarnhylkisprótein veirunnar. Þessar RNA stilklykkjur kallast
pökkunarmerki og eru almennt staðsettar milli aðalsplæsgjafa
(MSD) veirunnar og upphafstákna gag gensins. MVV er frum-
gerð lentiveira og sýkir kindur. Engar rannsóknir hafa verið
birtar um pökkunarraðir MVV. Markmið okkar var að skilgreina
pökkunarraðir MVV til að auka almennan skilning í pökkun lenti-
veira og til að betrumbæta pökkun MVV genaferja.
Efniviður og aðferðir: Við bárum saman „leader raðir" frá bindi-
seti vísis að upphafstákna gag nokkurra MVV stofna með tilliti
til varðveislu og reiknuðum út stöðugustu RNA strúktúrana með
tölvuforritinu Mfold. Síðan smíðuðum við afbrigði af veirunni
með ýmsar úrfellingar ofanvert og neðanvert við MSD. Við inn-
leiddum úrfellingaafbrigðin ásamt villigerð veirunnar í kinda- og
mannafrumur. RNA erfðaefni var magnmælt innan og utan frumu
með rauntíma RT-qPCR í LightCycler. Tjáning Gag próteina var
staðfest með Western blettun. Til að skilgreina pökkun úrfellinga-
afbrigðanna tókum við hlufall erfðaefnis utan og innan frumu og
reiknuðum pökkunarskilvirkni sem prósentu af villigerð.
Niðurstöður: í Ijós kom að raðir ofanvert við MSD miðluðu
ekki pökkun. Pökkunarraðir reyndust vera neðanvert við MSD.
Úrfelling 168 bp svæði milli MSD og upphafstákna gag sýndi um
15% pökkunarvirkni en olli auk þess smávægilegri skerðingu
á Gag tjáningu. Úrfelling varðveittrar 35 bp stilklykkju á þessu
svæði minnkaði pökkunarvirkni niður í 40% án þess að skerða
tjáningu Gag próteina. Prátt fyrir skerta pökkunarvirkni 35 bp
stilklykkjunnar, mældust 7,3 * 105 veiruerfðaefnis eintök per ml
flot.
Ályktanir: Pökkunarraðir MVV virðast vera dreifðar um erfða-
efnið, það er þær eru ekki eingöngu í „leader" röðinni.
E 36 HFE arfgerðargreining meðal íslenskra blóðgjafa og
hagur þeirra af C282Y arfblendni
Jóníiiu Jóliunnsdóttir12, Hildur Björnsdóttir', Sveinn Guðmundsson’, Ina
Hjálmarsdóttir3, Guðmundur M. Jóhannesson4, Birna Björg Másdóttir', Jón
Jóhannes Jónsson1-2, Eiríkur Steingrímsson2
'Erfða- og sameindalæknisfræðideild rannsóknastofnunar Landspítala, 2líf-
efna- og sameindalíffræðistofa læknadeildar HI, -’Blóðbankinn, Jblóðmeina-
fræðideild
joninajo@hi.is
Inngangur: Járn er lífsnauðsynlegt fyrir allar lífverur en það
þarf að vera í hæfilegu magni. Of mikið járn getur valdið líffæra-
skemmdum, en of lítið jám veldur blóðleysi. Hemókrómatósa er
arfgengur efnaskiptagalli sem stafar af aukinni upptöku jáms í
smáþörmum og ofhleðslu járns í vefjum. Tilgátur eru uppi um að
útbreiðsla C282Y stökkbreytingarinnar hafi orðið mikil vegna þess
að hún veiti vörn gegn járnskorti. Tilgangur þessarar rannsóknar
var meðal annars að kanna tíðni stökkbreytinga í HFE geni meðal
íslenskra blóðgjafa og tengsl stökkbreytinganna við járnbúskap.
Efniviöur og aöferðir: Samsætutíðni stökkbreytinga í HFE geni
hjá blóðgjöfum var fundin með rannsókn á 350 dulkóðuðum sýn-
um. Blóðgjöfum var skipt í fjóra hópa: hetjublóðgjafa sem gefið
höfðu blóð oftar en 75 sinnum, blóðgjafa með háar járnbirgðir,
blóðgjafa með lágar járnbirgðir og handahófsúrtak. Einnig voru
hetjublóðgjafar bornir saman við heildarhóp annarra blóðgjafa
(það er hinir hóparnir þrír sameinaðir) og við fyrri rannsókn á
handahófsúrtaki einstaklinga fæddra 1996. Arfgerð var ákveðin
með PCR og ensím skurði.
Niöurstöður og ályktanir: Samsætutíðni C282Y stökkbreytingar-
innar meðal blóðgjafa er 6,4% (±1,7%), H63D 10,7% (±2,2%)
og S65C 3,6% (±1,3%). Tíðni HFE stökkbreytinga meðal blóð-
A
36 Læknablaðid/fylgirit 50 2004/90