Ráðunautafundur - 15.02.1999, Side 256

248
hreint beta-eiturprótein í nægilegu magni var hægt að nota það sem staðal og í framhaldi af
því var ELISA aðferð stöðluð til að mæla framleiðslu beta-eiturpróteins.
Næsta skref var að nota aðferðir erfðatækninnar til að framleiða mismunandi stöklíbrigði
beta-eiturpróteins. Þetta var gert með það fyrir augum að leita að stökkbrigði sem framleitt
væri í miklu magni, hefði enga eiturvirkni en gæft samt vernd sem bóluefni. Ræktunarflot
sem innihéldu mismunandi stökkbrigði voru mæld með ELISA aðferð og magn beta-eitur-
próteins borið saman við þekktan staðal (2. tafla).
Að því búnu var metin eiturvirkni mismunandi stöldcbrigða. Eina leiðin sem hingað til
hefur reynst fær til að meta eiturvirkni beta-eiturpróteins er að prófa það í músum. Mýsnar
eru sprautaðar með próteininu og dauðaskammtur (lethal dose, LD5o) ákvarðaður, þ.e. magn
eiturpróteins sem drepur 50% músa. Mjög eitrað prótein hefur lágan dauðaskammt og öfugt.
í upphafi var reynt var að nota mismunandi frumulínur til að meta virkni beta-eitur-
próteinsins, en engin þeirra reyndist nothæf á í þessu tilfelli. Frumulínur eru þó notaðar við
virknimælingar ýrnissa annarra eiturpróteina. Af þessum sökurn reyndist óhjákvæmilegt að
nota mýs til að rnæla eiturvirlcni stöklcbrigðanna (2. tafla).
2. tafla. Villigerð (pPB 14) og stökkbrigði (R239Q, R239E, pXB30) beta-
eiturpróteins sem framleidd voru í Bacillus subtilis. Próteinframleiðsla
(pg/ml) og dauðaskammtur (letlial dose, LD50 mælt í pg/kg mús) próteins.
Beta-eiturprótein Framleiösla (pg/ml) LD50 (pg/kg músý)
pPB14 4,0 1,1
R239Q 1,6 6,0
R239E 1,6 Drepur ekki
pXB30 4,4 12,7
a) Hár dauðastyrkur = lítil eiturvirkni.
Út frá ELISA mælingum og álcvörðun á „lethal dose“ voru valin tvö stöldcbrigði R239Q
og R239E sem gáfú góða framleiðslu á eiturpróteini, en höfðu litla eða enga eiturvirkni miðað
við villigerðina pPB14 (óbreytt beta-eiturprótein framleitt í B. subtilis).
Kanínubólusetning
Kanínur voru bólusettar annars vegar með stöklcbrigði R239Q og hins vegar með R239E.
Þróuð var ELISA aðferð til að mæla mótefni gegn beta-eiturpróteini í lcanínum. Einnig var
þróuð aðferð til að meta verndandi áhrif lcanínumótefna í músum. Blóð var tekið úr kanín-
unum með jöfnu millibili. mótefni mæld og verndandi álirif þeirra metin.
Mótefni gegn stökkbrigðum verða að þekkja villigerð beta-eiturpróteins (óbreytt prótein),
því að öðrum kosti gagnast stöklcbrigðin elcki til að bólusetja gegn náttúrulegri sýkingu.
Bæði stökkbrigðin lcomu af stað mótefnamyndun í bólusettum kanínum og mótefnin
þekktu í báðum tilfellum villigerð beta-eiturpróteins. Mótefni gegn óeitraða stöldcbrigðinu
R239E veittu ekki vernd gegn eiturvirlcni beta-eiturpróteins, þrátt fyrir ítrekaðar bólu-
setningar. R239Q, sem hafði litla eitur\'irkni, vakti aftur á móti verndandi mótefnasvar í kan-
ínum. Til að fullreyna hvort R239E gæti vakið vemdandi mótefnasvar eða eldci voru kanínur
bólusettar með sterkara atbrigði þess pXB30 (2. tafla). Þrátt fýrir ítrelcaðar bólusetningar og
góða mótefnamyndun voru mótefnin elcki verndandi.
Músabólusetning
Stöklcbrigði R239Q var síðan valið til að gera bólusetningartilraun í músum. Músunum var
skipt í 4 hópa (3. tafla) sem bólusettir vom þrisvar sinnum með 14 daga millibiii. Blóð var