Læknablaðið - 15.02.2001, Blaðsíða 25

FRÆÐIGREINAR / BARNALÆKNISFRÆÐI
: 5TGCAATCAAAGTGGAGCCTGCATGTC3'
og: 5'CAGAAGCTTTATCTCCACAGAC3'.
Fjölliðunarhvarfið hófst á eðlissviptingu (denatur-
ation) við 95°C í fimm mínútur svo voru endurteknir
39 hringir sem samanstóðu af: eðlissviptingu (94°C í
30 sekúndur), temprun (annealing) (61°C í 30
sekúndur) og lengingu (extension) (72°C í 30
sekúndur). Eftir hringina 39 tók við lenging við 72°C
í eina mínútu. + þreifarinn er breyttur þar sem sett er
inn G í stað C þremur bösum fyrir ofan umrædda
stökkbreytingu. Þetta er gert til þess að mynda
skerðiset fyrir skerðiensímið Hinc II (Pharmacia
Biotech) ef stökkbreytingin er fyrir hendi (mynd 1).
Ef stökkbreytingin er fyrir hendi klippir Hinc II
131 basaparabútinn, sem magnaður var upp, í tvo
búta sem eru 26 bp annars vegar og 105 bp hins vegar.
Fjölliðunarhvarfsafurðin var melt með átta einingum
af Hinc II skerðiensíminu við 37°C í um einn og
hálfan klukkutíma og svo rafdregin á 4% agarósageli
í 1% TBE búffer, merkt með ethidíum brómíði og
skoðuð í útfjólubláu ljósi. Ef einstaklingur reynist
arfhreinn fyrir umrædda stökkbreytingu koma fram
tvö bönd (26bp+105bp) en ef hann er arfblendinn
koma fram þrjú bönd (26bp+105bp+131bp). Hins
vegar ef viðkomandi er arfhreinn án stökkbreytingar
kemur aðeins fram eitt 131 bp band. Til stærðar-
greiningar á þeim böndum sem fram komu var notast
við þX - 174 - RF DNA Hae III meltiafurð
(Pharmacia Biothech). Ferlið var tvítekið fyrir hvert
sýni.
Til að leita að öðrum basabreytingum á þessum
sama 131 bp bút var beitt ensími sem greinir
stökkbreytingar (enzymatic mutation detection,
EMD'™’). Notað var PASSPORT Mutation
Scanning Kit (Amersham Pharmacia Biotech AB).
Búturinn var magnaður upp með fjölliðunarhvarfi
með sömu þreifurum og áður en bætt inn geisla-
merktu adenósíni, [a-33P]ATP. Einnig var magnaður
upp bútur úr heilbrigðum einstaklingi (villigerð) með
sömu aðferðum. Fjölliðunarhvarfið hófst sem fyrr á
eðlissviptingu við 95°C í fimm mínútur. Að því búnu
var eftirfarandi hringur endurtekinn 35 sinnum:
eðlissvipting (94°C í 30 sekúndur), temprun (61 °C í
30 sekúndur) og lenging (72°C í eina mínútu). Að
lokum var lengt í eina mínútu við 72°C. Að því búnu
voru myndaðir heteródímerar úr villigerðinni og
þeim einstaklingum sem rannsaka á. Var þetta gert
með því að blanda saman fjölliðunarhvarfsafurðum
þátttakanda og villigerðar ásamt blendingslausn
(hybridization buffer). Að því loknu voru
blöndurnar hitaðar við 100°C í fimm mínútur og svo
hafðar við stofuhita í um 10 mínútur. Síðan var
afurðin melt með skerðiensíminu Tj endonucleasa
VII við 37°C í um tvær klukkustundir. Skerðiensímið
þekkir og klýfur heteródímerinn þar sem mispörun
eða lykkjumyndun verður. Alltaf er einhver ósértæk
melting fyrir hendi en ef um basabreytingar er að
5'CTCCAC3'
eðlile8' 3'GAGGTG 5'
stökkbreytt 5'(0)TC|rA)AC3'
3'(C)AG||(T)TG5'
Mynd 1. Breytingar sem verða á bösum 341-346 ícDNA-röð PPARy2 við notkun breytts
áframprímers við fjölliðunarhvarfið, ef stökkbreyting erfyrir hendi. Svigar eru settir utan
um þá basa sem breytast. Þverstrikin tvö tákna þann stað sem Hinc II skerðiensímið
klýfur. Efri basaröðin er sú eðlilega. íþeirri neðri sjást þœr breytingar sem verða. G í
stöðu 341 er sett inn ístað C með breytta þreifaranum. Ef stökkbreytingin Proll5Gln er
fyrir hendi kemur A í stað C í stöðu 344. Efbáðar þessar breytingar erufyrir liendi á
Hinc II að þekkja og kljúfa þetta svœði.
Mynd 2. Niðurstöður fjölliðunarhvarfs-skimunar fyrir stökkbreytingunni Proll5Gln í
PPARy2. Framkvæmt var fjölliðunarhvarf melting með skerðiensíminu Hinc II og
rafdráttur á 4% agarósageli eftir merkingu með ethidíum brómíði, líkt og lýst var í
aðferðakaflanum. Hér að ofan gefur að líta mynd af slíku geli skoðuðu í útfjólubláu Ijósi.
ífyrsta brunn frá vinstri var ekki sett nein fjölliðunarhvarfsafurð, en íþeim sjö nœstu sjást
greinilega stök bönd sem eru að öllum líkindum 131 bp samkvœmt þvísem áður segir.
Hér hefur því ekki orðið nein skerðing með ensíminu og því engin stökkbreyting fyrir
hendi. Niðurstöður annarra sýna voru sambœrilegar.
ræða á meltingin að verða meiri og sérhæfðari. Meltir
bútarnir eru svo rafdregnir á 6% raðgreiningargeli í
0,5% TBE búffer. Gelið var flutt yfir á filterpappír og
lagt í röntgenhirslu og filman svo framkölluð eftir tvo
sólarhringa. Ferlið var tvítekið fyrir hvert sýni
Til að kanna nánar þá einstaklinga sem gefið
höfðu grunsamleg svör með EMD var erfðaefni
þeirra á þessu svæði að lokum raðgreint. Fyrst voru
Læknablaðið 2001/87 121