Læknablaðið : fylgirit - 01.01.2011, Blaðsíða 138

XV VÍSINDARÁÐSTEFNA HÍ
FYLGIRIT 66
geta höndlað DNA skemmdir sem verða til dæmis vegna útfjólublárrar
geislunar. Þar má nefna umritunarháða DNA viðgerð og ubiquitin
merkingu á RNA pólímerasa II (RNAPII). Próteinið ubiquitin tengist
öðrum próteinum með samgildum tengjum sem oftast veldur því að
þau eru brotin niður, stundum getur staðsetning eða virkni próteinanna
þó breyst. Markmið rannsóknarinnar er að auka skilning okkar á
svari frumna við DNA skemmdum, sérstaklega með tilliti til ubiquitin
merkingar á RNAPII sem hefur stöðvast á DNA skemmd.
Efniviður og aðferðir: Kerfi til að merkja RNAPII með ubiquitin
(RNAPII-Ub) hefur verið sett upp. Það samanstendur af eftirtöldum
hreinsuðu próteinum: El, UBC5 sem E2 og Rsp5 sem ubiqutin ligasi eða
E3 ásamt RNAPII og ubiquitin. Virkni RNAPII-Ub var rannsökuð, bæði
stöðugleiki á DNA og einnig virkni í in vitro umritunarkerfum. Einnig
verður reynt að svara spurningunni hvernig er valið hvaða sameindir af
RNAPII eru merktir með ubiquitin.
Niðurstöður: Merking RNAPII með ubiquitin hefur engin áhrif á
stöðugleika ensímsins á DNA. RNAPII-Ub hefur heldur ekki tapað
neinni virkni í umritunarkerfum sem rannsökuð voru þrátt fyrir að
ubiquitin merkið sé mjög nálægt virka seti RNAPII. Ubiquitin virðist
vera hengt á RNAPII sem hefur stöðvast á DNA skemmd á meðan
RNAPII í virkri umritun og eins þær sameindir sem ekki eru bundnar
DNA eru ekki merktar.
Alyktanir: Merkingar á RNAPII virðast ekki hafa nein áhrif á virkni
próteinsins. RNAPII er stöðugt á DNA sameindinni og getur haldið
áfram umritun. Þær RNAPII sameindir sem merktar eru hafa líklega
stöðvast á DNA skemmd og hafa bakkað frá henni. Sameindir í þessari
stöðu eru því merktar með ubiquitin og brotnar niður á meðan öðrum
sameindum er hlíft.
V 174 Umritunarþátturinn p63 stýrir myndun sýndarlagaskiptrar
lungnaþekju í rækt
Ari Jón Arason1-', Sigríður Rut Franzdóttir12, Ólafur Baldursson'-4, Þórarinn
Guðjónsson1-2, Magnús Karl Magnússon'-2-3
'Rannsóknastofu í stofnfrumufræðum HÍ, 2rannsóknastofu í blóðmeinafræði Landspítala,
'rannsóknastofu í lyfja- og eiturefnafræði HÍ, 4lungnalækningadeild Landspítala
aja1@hi.is
Inngangur: Sýndarlagskipt þekja (sl-þekja) í efri loftvegum er
mikilvæg í vörnum lungna og breytingar á henni tengjast bæði
sýkingum og myndun krabbameins. Þéttitengi milli lungnafrumna eru
nauðsynleg til að viðhalda skautun frumnanna og vömum þekjunnar.
Umritunarþátturinn p63 sem er nauðsynlegur fyrir þroskun og
viðhald lagskiptrar þekju (til dæmis húð) er tjáður í basal frumum í efri
loftvegum. Tvö mismunandi splæsform eru til af p63, transactivation
domain(TA)-p63 og D-N-p63. Markmið rannsóknarinnar er að kanna
hlutverk p63 í myndun sl-þekju í mönnum.
Efniviður og aðferðir: Frumulínan VAIO myndar sl-þekju í air-
liquid (ALI) ræktunarkerfi. Transepithelial resistance (TER) segir til
um styrk þéttitengja. Þöggun á p63 tjáningu var gerð með shRNA
lentiveiruinnskoti. Mótefnalitanir og Western blot sýna próteintjáningu.
q-RT-PCR fyrir mRNA tjáningu.
Niðurstöður: í lungnavef er tjáning á p63 metin með ósérhæfðu mótefni
bundin við basal frumur. Sérhæft mótefni gegn D-N-63 hefur svipað
tjáningarmynstur. í ALI ræktun er D-N-p63 tjáð í basalhluta þekjunnar
en hverfur í efri hluta þekjunnar, svipað og með ósérhæfðu p63 mótefni.
Sýking á VAIO (VA10-p63kd) með lentiveiru sem kóðar shRNA röð gegn
p63 mRNA leiðir til verulegrar bælingar á próteinmyndun. VA10-p63kd
frumur ná ekki að mynda þroskuð þéttitengi í ALI rækt, þar sem þekjan
myndar ekki hátt TER borið saman við VAIO. Einnig hefur hún aukið
vökvagegndræpi. VA10-p63kd frumur hafa aukna tjáningu á epithelial-
specific antigen (ESA), en slík tjáning hefur meðal annars verið tengd við
lungnastofnfrumur.
Alyktanir: D-N-p63 virðist vera ráðandi splæsform af p63 í lungum.
Ef p63 er þaggað verður ekki til eðlileg sl-þekja í rækt sem bendir til
mikilvægis p63 í þroskun og sérhæfingu lungnaþekju. Rannsóknir miða
að því kanna ítarlega hlutverk p63 í stofnfrumum lungna.
V 175 Hlutverk og starfsemi IRF4 gensins í litfrumum og
sortuæxlisfrumum
Christine Grill, Christian Praetorius, Alexander Schepsky, Eiríkur Steingrímsson
Lífefna- og sameindalíffræðistofu og lífvísindasetri læknadeild HÍ
chgrill@hi.is
Inngangur: MITF (Microphtalmia-associated transcription factor)
er umritunarþáttur sem er nauðsynlegur fyrir þroskun litfrumna og
viðhald sortuæxlisfrumna. í nýlegri leit okkar að markgenum MITF
í sortuæxlum fundum við nokkur ný áhugaverð gen. Áhugaverðasta
genið, Interferon regulatory factor 4 (IRF4), er tjáð í flestum
sortuæxlum og hefur verið tengt við húð- og háralit í mönnum. IRF4
er umritunarþáttur sem gegnir mikilvægu hlutverki í þroskun og
starfsemi B-frumna en er einnig æxlisgen (oncogene). í verkefni þessu
var rannsakað hvort IRF4 og MITF vinna saman við stjómun á umritun
markgena í litfrumum og sortuæxlisfrumum.
Efniviður og aðferðir: I stjórnröð TYR gensins, eins af markgenum MITF,
eru tvö IRF4 bindiset sitt hvoru megin við MITF bindisetin. Til að greina
hvort MITF og IRF4 starfa saman við að örva tjáningu TYR gensins
var notast við co-transfection rannsóknir í ýmsum frumugerðum. IRF4
og MITF bindisetunum var stökkbreytt til að athuga hlutverk stakra
bindiseta. Einnig var notast við mótefnafellingar og ChlP aðferðina til
að greina hvort IRF4 og MITF próteinin bindast viðkomandi setum í
litfrumum.
Niðurstöður: MITF og IRF4 hafa samlegðaráhrif við virkjun á tjáningu
TYR gensins; þegar bæði eru til staðar verður mun meiri virkjun
umritunar en þegar einungis annað próteinanna er til staðar. Með því
að stökkbreyta IRF4 bindisetunum hverfa þessi samlegðaráhrif. Ekki
hefur enn tekist að mótefnafella IRF4 og MITF próteinin eða nota ChlP
til að sýna að þau séu bæði til staðar í stýriröðinni. Með RT-qPCR
magnmælingu kom í ljós að bæði IRF4 og MITF eru tjáð í flestum
sortuæxlis- og litfrumulínum.
Ályktanir: Við höfum sýnt að MITF og IRF4 vinna saman í því að virkja
umritun TYR gensins. Þar sem TYR tjáir fyrir ensími sem framleiðir
litarefnið melanín er hér komin ein skýring á tengslum IRF4 við húð- og
háralit. Við vinnum nú að því að greina hlutverk IRF4 í sortuæxlum.
V 176 Kristalbygging MITF umritunarþáttarins veitir upplýsingar um
DNA-bindieiginleika og tvenndarmyndun
Vivian Pogenberg', Kristín Bergsteinsdóttir2, Alexander Schepsky2, Bengt Phung2,
Matthias Wilmanns', Eiríkur Sleingrímsson2
'European Molecular Biology Laboratory, Hamborg, 2lífefna- og sameindalíffræði læknadeild
Hí
eihkurs@hi.is
Inngangur: MITF (Microphtalmia-associated transcription factor)
er umritunarþáttur sem er nauðsynlegur fyrir þroskun litfrumna
138 LÆKNAblaðið 2011/97