Læknablaðið : fylgirit - 01.01.2011, Blaðsíða 45

XV VÍSINDARÁÐSTEFNA HÍ
FYLGIRIT 66
E 86 Faraldsfræði nýrnaveiki af völdum Renibacterium
saimoninarum í laxfiskum á íslandi
Sigríður Guðmundsdóttir, ívar Örn Ámason, Sigurður Helgason, Ámi
Kristmundsson
Tilraunastöð HÍ í meinafræði að Keldum
siggag@hi.is
Inngangur: Nýrnaveiki í laxfiskum, af völdum Gram jákvæðu
bakteríunnar Renibacterium salmoninarum, getur orskað erfiðleika í eldi.
Fiskurinn getur borið bakteríuna mánuðum og jafnvel árum saman
án einkenna, sýklalyf gagnast ekki og nothæft bóluefni er ekki tiltækt.
Bakterían smitast bæði milli einstaklinga og milli kynslóða í hrognum.
Bakterían og mótefnavakar sem hún seytir finnast í ýmsum líffærum,
og valda fjölbreytilegum einkennum. Bakterían greindist í fyrsta skipti
á íslandi árið 1968 og aftur 1977-78. Árin 1985-1992 varð nýrnaveiki
vandamál í kjölfar aukningar í laxeldi. Á árunum 1992-2003 var allt með
kyrrum kjörum en þá hófst faraldur í eldisstöðvum sem nú er að fjara
út. Á sama tíma greindust æ fleiri smitaðir villifiskar sem notaðir voru
til fiskiræktar.
Efniviður og aðferðir: Sjúkdómsgreiningar, skimun einkennalausra
fiska og rannsóknir á Renibacterium salmoninarum hafa verið á dagskrá
rannsóknadeildar fisksjúkdóma á Keldum í aldarfjórðung. Þessi
efniviður var notaður til að draga fram helstu þætti í faraldsfræði
nýrnaveikinnar. Niðurstöður ná til eldisfisks og villtra stofna sem
notaðir eru til að ala undan seiði til sleppinga í ár og vötn (fiskirækt)
og til sýna sem hafa verið tekin úr villtum fiski í rannsóknaskyni.
Einangrun með ræktun tekur 4-12 vikur. Algengasta skimunaraðferðin
er ELISA próf sem greinir mótefnavaka og PCR greiningum er nú beitt
> vaxandi mæli.
Niðurstöður: Það hefur mikla efnahagslega þýðingu að hefta útbreiðslu
bakteríunnar og lykilatriði í þeim árangi sem náðst hefur í eldisstöðvum
er skimun klakfisks og hraðvirkar greiningaraðferðir. Mikilvægt er að
afla meiri þekkingar á hegðun bakteríunnar í einstaklingum, rannsaka
wun milli tegunda laxfiska, smitleiðir og samspil hýsils og sýkils.
Ályktanir: Smit í urriða og bleikju, sem ekki ganga til sjávar, virðist vera
mikilvæg uppspretta smits í vatnakerfinu hérlendis.
E 87 Nýrnaveikibakterían í sýktum eldisklaklaxi. Samanburður
9reiningaraðferða
ívar Örn Árnason1, Sunna Sigurðardóttir, Ámi Kristmundsson1, Sigurður
Helgason1, Vilhjálmur Svansson1, Sigríður Guðmundsdóttir1
‘Tilraunastöð HÍ í meinafræði að Keldum, !Lifeinda- og sameindalíffræðistofu HÍ
,varahQgmail.com
Inngangur: Skimun fyrir Renibacterium salmoninarum, bakteríunm
sem veldur nýrnaveiki í laxfiskum, er oftast framkvæmd með
ELISA prófi sem nemur mótefnavaka bakteríunnar. Til að staðfcsta
jákvætt svar, í áður ósýktri eldisstöð, þarf að nota ólíka aðferð.
Álþjóðadýraheilbrigðisstofnunin mælir með nested PCR til staðfestingar.
Nleginmarkmið verkefnisins var að þróa nýja PCR aðferð, semi-nested
pCR, og bera saman við nested PCR og ýmsar aðrar aðferðir til
greirtingar á Renibacterium salmoninarum. Einnig var prófuð ný aðferð
til að einangra DNA úr sýnum og hún var borin saman við hefðbundna
DNA einangrunaraðferð.
Efniviður og aðferðir: Tvær ELISA aðferðir voru bomar saman, önnur
n°tar fjölstofna mótefni, pELISA, og hin þar sem einstofna mótefni eru
n°tuð, mELISA. Fjórar mismunandi PCR aðferðir voru prófaðar, það er
semi-nested PCR, nested PCR, qPCR og RT-qPCR. Tvö mismunandi gen
eru mögnuð upp í qPCR og RT-qPCR. f nested PCR eru notaðir fjórir
prímerar sem framleiða tvær mismunandi afurðir í aðskildum hvörfum.
Afurðinni úr fyrra hvarfinu, sem er framleitt úr einu prímerapari, er
flutt í glas með seinna prímeraparinu og ný afurð mynduð út frá þeirri
fyrri. Við flutninginn myndast mengunarhætta. í semi-nested PCR eru
notaðir þrír prímerar sem framleiða tvær mismunandi afurðir en í sama
PCR hvarfi. Ekki þarf að flytja afurðir á milli hvarfa sem minnkar þar
af leiðandi mengunarhættuna. Prófuð var DNA einangrunaraðferð þar
sem sýni eru sett á svokallaðan FTA pappír sem inniheldur ensím til
að brjóta niður frumuveggi og dúa til að varðveita kjamsýrurnar. Lítill
bútur er klipptur úr pappírnum sem inniheldur sýnið og settur í PCR
glas. Búturinn er þveginn og þurrkaður áður en hann er notaður sem
DNA mót fyrir PCR hvarf. Hefðbundin einangrunaraðferð var höfð til
samanburðar (kitt frá Puregene).
Niðurstöður: pELISA aðferðin greindi flest jákvæð sýni í sýnahópnum
en mELISA aðferðin fæst. Nýja DNA einangrunaraðferðin reyndist
gefa fleiri jákvæð sýni í PCR samanborið við hina hefðbundnu
einangmnaraðferð. Semi-nested- og nested PCR gáfu sambærilegar
niðurstöður og námu fleiri jákvæð sýni en bæði qPCR og RT-qPCR.
Ályktanir: snPCR aðferðin hefur marga kosti fram yfir nPCR aðferðina;
minni kostnað, aukinn tímasparnað og minni mengunarhættu.
Einangrun DNA úr sýnum með FTA pappír er þægilegri og einfaldari
aðferð en hefðbundin einangrun með DNA „kitti", auk þess sem sýni á
FTA pappírnum geta geymst í stofuhita í mörg ár.
E 88 Sýkingarmætti bakteríunnar Aeromonas salmonicida er
stjórnað af þéttniskynjun
Bjarnheiður K. Guðmundsdóttir, Johanna Schwenteit, Þórunn Guðmundsdóttir,
Bryndís Björnsdóttir
Tilraunastöð HÍ í meinafræði að Keldum
bjarngud@hi.is
Inngangur: Þéttniskynjun með efnaboðum gerir bakteríum kleift að
stjórna genatjáningu í samræmi við fjölda þeirra í bakteríusamfélögum.
Margar G-neikvæðar bakteríur nota LuxIR- þéttniskynjun byggða
á N-acyl-homoserinelactone (AHLs) boðeindum. Luxl er synþasi
sem stuðlar að myndun AHL sameinda og LuxR er AHL-háður
umritunarþáttur. A. salmonicida undirtegund achromogenes (Asa) veldur
kýlaveikibróður í fiski. Asa hefur LuxIR-gerð af þéttniskynjun nefnda
AsalR. Markmið rannsóknarinnar var að kanna áhrif þéttniskynjunar á
sýkingarmátt Asa með áherslu á hlutverk Asal synþasans.
Efniviður og aðferðir: Framleiðsla AHL sameinda var könnuð
með massagreiningu utanfrumuafurða Asa. Asal neikvætt Asa
stökkbrigði var gert með markvissri stökkbreytingu. Sýkingarmáttur
stökkbrigðisins var borinn saman við sýkingarmátt móðurstofnsins í
tilraunasýktri bleikju. Tjáning stofnanna á frumubundnum og seyttum
þáttum var líka borin saman. Tvívíður rafdráttur var notaður við
samanburð á frumubundnum þáttum. Samanburður á seyttum þáttum
var gerður með massagreiningu, virknimælingum, ónæmisþrykki og
ljósgleypnimælingum.
Niðurstöður: Aðeins ein AHL gerð, N-butanoyl-L-homoserine lactone
(C4-HSL), greindist í seyti Asa. Asal-neikvæði stofninn framleiddi
ekki greinanlega boðsameind. Sýkingarmáttur stökkbreytta stofnsins í
bleikju var marktækt veiklaður. Banaskammtur stökkbrigðisins var 20
sinnum hærri en móðurstofnsins og smittími hans var líka lengri. Ekki
greindist munur á tjáningu stofnanna á frumubundnum próteinum,
en í seyti var rnirrni tjáning eftirtalinna sýkiþátta hjá stökkbreytta
LÆKNAblaðið 2011/97 45